小鼠结肠成纤维细胞的分离培养方法及标准操作流程！
小杨 / 2026-03-16 09:10:56
小鼠结肠成纤维细胞是分离自小鼠结肠组织的贴壁生长细胞，呈典型梭形，是结肠间质的核心细胞之一，在组织稳态、损伤修复、炎症与肿瘤发生发展中扮演关键角色，是肠道相关基础与转化研究的常用模型。
一、试剂与耗材
无菌 PBS（含双抗）
消化液：0.1% 胶原酶 Ⅳ + 0.05% 胰酶/EDTA（DMEM/F12 配制）
完全培养基：DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗
70 μm 细胞筛网
6 cm/10 cm 培养皿
二、操作步骤（无菌超净台）
1、取材
处死 6–8 周小鼠，75% 酒精消毒腹部。
开腹取结肠（从盲肠到直肠），放入预冷无菌 PBS。
用 PBS 反复冲洗肠腔内容物，尽量干净。
剔除脂肪、系膜，纵向剪开肠管。
2、去除上皮（关键）
肠片放入含双抗的 PBS，轻轻刮擦黏膜面，去掉上皮层。
PBS 洗 2–3 次，直到黏膜面不光滑、偏白。
→ 这一步决定上皮污染多少。
3、剪碎 & 消化
将肠组织剪成 1 mm³ 左右碎块。
加入预热消化液，37℃摇床消化 60–90 min，期间吹打数次。
4、过滤 & 终止消化
消化液通过 70 μm 滤网过滤。
滤液加完全培养基终止消化（体积≥3 倍）。
1000 rpm × 5 min 离心，弃上清。
5、重悬 & 差速贴壁纯化（关键）
沉淀用完全培养基重悬，接种到培养皿。
37℃孵育 45–60 min
→ 成纤维细胞先贴壁，上皮/免疫细胞悬浮。
轻轻吸走悬浮液，PBS 洗 1 遍，换新培养基。
6、培养与传代
37℃、5% CO₂ 培养
48 h 首次换液，之后每 2–3 天换液
细胞汇合 80%–90% 传代
用 0.25% 胰酶/EDTA 消化 1–2 min 即可
三、细胞鉴定（简单版）
阳性：Vimentin（+）
静息成纤维：α-SMA（-/弱 +）
活化/肌成纤维：α-SMA（+）
四、常见问题 & 技巧
上皮污染严重
→ 多刮黏膜、延长差速贴壁时间。
不贴壁/不活
→ 胶原酶失效、消化过度、FBS 质量差。
生长慢
→ 用 DMEM/F12 比普通 DMEM 更好。
建议代数
→ P0–P3 最稳定，P4 以后易表型改变。
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