小鼠肾小管上皮细胞的培养方法与操作步骤及质量控制！
小杨 / 2026-03-02 09:47:09
小鼠肾小管上皮细胞的培养方法主要分为原代培养（直接从肾组织分离）和细胞系培养（使用永生化细胞系），两种方法各有适用场景，以下是详细的“操作手册式”介绍，包含原理、步骤、优化方案及问题排查：
一、原代培养（金标准，保留天然生理特性）
1、原理
通过机械分离 + 酶解消化小鼠肾皮质组织，获得肾小管片段或单个上皮细胞，利用上皮细胞的贴壁特性和选择性培养基纯化，去除间质细胞（如成纤维细胞），最终获得高纯度原代 RTECs。
2、适用场景
肾脏疾病机制研究（如急性肾损伤、糖尿病肾病的细胞级机制）；
药物肾毒性的精准评价（更贴近体内生理状态）；
细胞极性、物质转运等基础功能研究。
3、核心试剂与材料
类别 具体试剂/材料
组织来源 6-8 周龄 SPF 级小鼠（C57BL/6 或 BALB/c，雌雄均可，体重 20-25g）
消化液 胶原酶 Ⅳ（1-2 mg/mL）+ 胰酶 - EDTA（0.25%），用无血清 DMEM/F12 配制
培养基 基础培养基：DMEM/F12（1:1）+ 10% FBS + 1% 双抗（青霉素 + 链霉素）；
优化添加：EGF（10 ng/mL）、胰岛素（5 μg/mL）、转铁蛋白（5 μg/mL）、氢化可的松（1 μg/mL）
分离工具 眼科剪、眼科镊、研磨器（或 200 目细胞筛）、离心管、培养皿（包被明胶或胶原 Ⅰ 型）
其他试剂 PBS（无钙镁）、0.1% 明胶溶液、台盼蓝染色液、上皮细胞鉴定抗体（CK18/CK19）
4、操作步骤（无菌环境下进行）
（1）组织分离与预处理
小鼠颈椎脱臼处死，75% 酒精浸泡 5 分钟消毒，无菌条件下打开腹腔，分离双侧肾脏，置于预冷的 PBS（无钙镁）中冲洗 3 次，去除包膜、血管和肾髓质（仅保留肾皮质，因肾小管主要集中在皮质）。
将肾皮质剪成 1mm³ 的细小组织块，用 PBS 反复吹洗，去除红细胞和杂质，静置后弃上清。
（2）酶解消化（关键步骤，避免过度消化）
向组织块中加入 5 倍体积的消化液（胶原酶 Ⅳ+ 胰酶 - EDTA 混合液），37℃、5% CO₂培养箱中振荡消化 30-40 分钟，每 10 分钟轻轻吹打 1 次，观察组织块分散情况。
当组织块大部分溶解，溶液呈浑浊状时，加入等体积含 10% FBS 的 DMEM/F12 终止消化，用 200 目细胞筛过滤，收集滤液（含肾小管片段和单个细胞）。
（3）离心纯化与接种
滤液在 800 rpm、4℃下离心 5 分钟，弃上清，用 PBS 重悬沉淀，重复离心 1 次，去除残留酶液。
用优化培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数（活细胞率需≥90%），按 1×10⁶ cells/cm² 的密度接种到预包被明胶（0.1%，37℃孵育 30 分钟后吸弃）的培养皿中。
置于 37℃、5% CO₂培养箱中培养，24 小时内不移动培养皿，让细胞充分贴壁。
（4）纯化与传代
接种后 48 小时更换培养基，去除未贴壁细胞和杂质；之后每 2-3 天换液 1 次。
当细胞融合度达到 80-90% 时进行传代：吸弃培养基，用 PBS 冲洗 2 次，加入 0.25% 胰酶 - EDTA，37℃孵育 2-3 分钟，显微镜下观察到细胞变圆、脱落时，加入含 FBS 的培养基终止消化，离心收集细胞，按 1:2 比例传代接种。
原代 RTECs 通常可传 3-5 代，超过 5 代后细胞易发生表型分化（如失去上皮极性），建议尽快使用。
5、优化方案（提高纯度和存活率）
贴壁促进：培养皿用胶原 Ⅰ 型（5 μg/cm²）或纤连蛋白（10 μg/cm²）包被，比明胶更适合上皮细胞附着；
杂质去除：利用“差速贴壁法”—— 首次接种后 2 小时，轻轻吸弃培养基，去除快速贴壁的成纤维细胞，再加入新鲜培养基（上皮细胞贴壁较慢，约 6-12 小时）；
培养基优化：添加 1% ITS（胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒）替代单独添加成分，维持细胞极性和代谢功能；
避免污染：全程无菌操作，肾组织分离时尽快去除血液（红细胞残留会影响细胞生长），双抗浓度可在首次培养时提高至 2%（传代后恢复 1%）。
二、细胞系培养（便捷高效，适合大规模实验）
1、原理
使用永生化的小鼠肾小管上皮细胞系，这类细胞经过体外驯化，具有稳定的增殖能力和典型的上皮细胞特性，无需复杂分离步骤，直接复苏培养即可。
2、适用场景
药物筛选、毒性评估（需大量均一细胞）；
基础实验（如细胞凋亡、信号通路研究）；
新手入门或快速获得实验材料。
3、常用细胞系及特性
细胞系 来源背景 核心特性 适用方向
TCMK-1 C3H/He 小鼠肾皮质 近端肾小管上皮细胞，多边形贴壁生长，表达 CK18/CK19 物质转运、药物肾毒性、炎症反应
MCT C57BL/6 小鼠肾髓袢升支 远端肾小管上皮细胞，高表达水通道蛋白（AQP2） 水盐平衡、肾小管损伤修复研究
mProx24 小鼠近端肾小管永生化细胞 增殖能力强，可传代 20 + 代，保留近端小管功能 大规模药物筛选、长期培养实验
4、操作步骤（以 TCMK-1 为例）
（1）细胞复苏
从液氮罐中取出冻存的 TCMK-1 细胞株，迅速放入 37℃水浴锅中，快速摇晃 1-2 分钟至完全融化（避免反复冻融）。
将融化的细胞悬液转移至离心管中，加入 5 倍体积的预热培养基（DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗），800 rpm 离心 5 分钟，弃上清（去除冻存液中的 DMSO）。
用新鲜培养基重悬细胞，接种到培养皿中，置于 37℃、5% CO₂培养箱中培养，24 小时后更换培养基。
（2）传代培养
当细胞融合度达到 70-80% 时传代（避免过度融合导致细胞分化）：吸弃培养基，PBS 冲洗 2 次，加入 0.25% 胰酶 - EDTA，37℃孵育 1-2 分钟（细胞系消化速度比原代快），显微镜下观察到细胞脱落时，加入终止液终止消化。
离心收集细胞，按 1:3-1:5 比例传代接种（细胞系增殖能力强，可适当提高稀释比例），3-4 天换液 1 次，每周传代 1-2 次。
（3）冻存保存
选择对数生长期的细胞，消化收集后，用冻存液（DMEM/F12 + 20% FBS + 10% DMSO）重悬，调整细胞浓度为 1×10⁶ cells/mL，分装到冻存管中。
程序降温：4℃放置 30 分钟→-20℃放置 2 小时→-80℃过夜→次日转入液氮长期保存。
5、优化方案（维持细胞系稳定性）
培养基一致性：严格使用推荐的基础培养基，避免频繁更换培养基类型；
避免过度传代：细胞系传代超过 30 代后可能出现表型漂移，建议定期复苏早期冻存的细胞，替换高代次细胞；
支原体检测：每 2-4 周检测 1 次支原体（使用支原体检测试剂盒），污染后及时处理（如使用支原体清除剂），避免影响实验结果。
三、两种培养方法的对比与选择
对比维度 原代培养 细胞系培养
生理特性 贴近体内状态，保留极性和功能 部分功能简化，表型稳定但可能漂移
操作难度 复杂，耗时（1-2 周获得可用细胞） 简单，高效（1-3 天获得可用细胞）
纯度控制 需纯化步骤（去除成纤维细胞） 无需纯化，纯度高（商业化细胞系）
实验重复性 个体差异较大，重复性一般 均一性好，重复性高
选择建议：
若实验需要模拟体内真实生理环境（如肾小管上皮 - 间质转化、药物转运机制），优先选择原代培养；
若实验需要大量均一细胞（如药物筛选、信号通路验证），或时间紧张，优先选择细胞系培养。
四、常见问题与故障排查
问题现象 可能原因 解决方案
原代细胞贴壁率低（<50%） 酶解过度/不足；培养皿未包被；组织处理不当 优化酶解时间（30-40 分钟）；用胶原 Ⅰ 型包被培养皿；减少组织块剪切时间，避免细胞损伤
原代细胞中混杂成纤维细胞 差速贴壁不充分；消化时间过长 延长首次贴壁时间至 2-3 小时后弃上清；缩短酶解时间，避免间质细胞过度释放
细胞生长缓慢 培养基营养不足；温度/CO₂浓度异常 添加 EGF、ITS 等生长因子；检查培养箱（37℃±0.5℃，CO₂ 5%±0.5%）；更换新鲜 FBS
细胞形态异常 过度传代；培养基中血清浓度过高 原代细胞传代不超过 5 代；细胞系传代不超过 30 代；血清浓度控制在 10%（原代可适当提高至 15%）
细胞污染（细菌/真菌） 无菌操作不规范；试剂污染 丢弃污染细胞；重新配制试剂；操作时戴手套、口罩，定期消毒超净台
细胞系表型漂移 过度传代；培养条件改变 复苏早期冻存的细胞；严格遵循推荐的培养条件，避免随意更换培养基
五、关键质量控制指标
形态学鉴定：显微镜下观察细胞呈多边形或鹅卵石样贴壁生长，具有上皮细胞典型形态；
标志物检测：通过免疫荧光或 Western blot 检测上皮细胞标志物（CK18、CK19、E - 钙粘蛋白），阳性率≥90%，间质细胞标志物（α-SMA）阴性；
功能验证：检测肾小管特异性功能（如近端小管细胞的葡萄糖转运功能、远端小管细胞的水通道蛋白表达），确保细胞功能正常；
无菌检测：培养过程中观察培养基是否浑浊、有无异味，定期检测支原体，确保细胞无污染。
北京百欧博伟生物技术有限公司的
微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！
下载附件
上一篇：栖旱境土新草小螺菌的培养特性与生态功能及应用领域！
下一篇：血细胞计数板实验的操作前准备工作及核心步骤有哪些？