小鼠子宫成纤维细胞的分离与培养标准流程及注意事项！
小杨 / 2026-02-11 11:21:34
小鼠子宫成纤维细胞的原代分离与培养标准流程，偏实操、步骤清晰、含关键质控点，适合写实验方案/直接操作。
一、实验前准备
器材：超净台、解剖剪 / 镊、15/50 mL 离心管、细胞筛（70 μm）、培养皿/瓶
试剂：
无菌 PBS（不含钙镁）
0.25% Trypsin-EDTA
Ⅱ 型胶原酶（Collagenase Ⅱ，1 mg/mL 左右）
完全培养基：DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗（Pen/Strep）
动物：6–8 周龄健康小鼠（雌、未孕常用），处死消毒后开腹取子宫。
二、组织取材（关键：快速、无菌、低温）
小鼠颈椎脱臼处死，75% 乙醇浸泡消毒。
开腹，取出双侧完整子宫，放入预冷无菌 PBS 中。
剔除脂肪、系膜、血管，用 PBS 冲洗 2–3 遍，去除血迹与黏液。
将子宫纵向剪开，暴露宫腔面，PBS 轻洗，去除内膜残留黏液。
三、组织消化（推荐：胶原酶 + 胰酶两步消化）
将子宫剪成 1 mm³ 左右碎块，移入 15 mL 离心管。
加入预热的 Collagenase Ⅱ（1 mg/mL），37 ℃消化 30–40 min，期间每 5 min 轻弹混匀。
加入等体积 0.25% Trypsin-EDTA，继续 37 ℃消化 10–15 min。
加入完全培养基（含血清）终止消化，反复吹打打散。
四、过滤、离心、去除杂质
消化悬液经 70 μm 细胞筛过滤，去除未消化组织块。
室温 1000–1500 rpm，5 min 离心，弃上清。
用完全培养基重悬细胞沉淀，接种到培养瓶/皿。
五、差速贴壁纯化成纤维细胞（最关键步骤）
子宫组织含上皮、基质、免疫细胞，必须纯化：
接种后放入 37 ℃、5% CO₂ 培养箱。
首次换液：6–8 h（只让成纤维细胞贴壁，上皮/血细胞悬浮）。
吸走悬浮液，PBS 轻洗 1 遍，加新鲜完全培养基。
此后每 24–48 h 换液一次。
结果：24–48 h 可见大量梭形、放射状生长的成纤维细胞；上皮细胞多为多角形、片状，可通过再次差速贴壁去除。
六、常规培养与传代
1、培养条件
培养基：DMEM/F12 + 10% FBS + 双抗
环境：37 ℃、5% CO₂、饱和湿度
2、传代时机
细胞融合度 80%–90% 传代
原代一般 3–5 天可传代
3、传代步骤
弃培养基，PBS 洗 1 遍。
加 0.25% Trypsin-EDTA，37 ℃消化 1–2 min，镜下见细胞收缩变圆即终止。
加完全培养基吹打，离心（1000 rpm，5 min），弃上清。
重悬，按 1:2 或 1:3 传代。
4、冻存
冻存液：90% FBS + 10% DMSO
程序降温盒 → -80 ℃过夜 → 液氮长期保存
七、细胞鉴定（判断是否为子宫成纤维细胞）
标准鉴定组合：
Vimentin（+）：间充质/成纤维细胞标志
Cytokeratin（CK，–）：排除上皮细胞
α-SMA（弱/部分 +）：部分肌成纤维表型正常
形态：典型长梭形、漩涡状生长
八、常见问题与注意事项（必看）
污染高发：子宫腔与外界相通，取材要快、冲洗充分、双抗浓度可临时略高。
1、上皮细胞过多：
缩短首次贴壁时间（4–6 h）
传代时再次利用差速贴壁纯化
2、细胞不贴壁/生长慢：
消化过度 → 缩短胰酶时间
FBS 质量差 → 更换优质胎牛血清
3、原代不要养太高代数
建议 P3 以内用于实验，表型最稳定
九、极简流程速记（方便写方案）
取材 → 剪碎 → 胶原酶 + 胰酶消化 → 过滤离心 → 接种 → 6–8 h 差速贴壁纯化 → 常规培养 → 传代 → 鉴定（Vimentin+）
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