凝胶膜过滤方法实验的操作流程与质量控制要点及注意事项！
小杨 / 2026-02-03 10:02:47
百欧博伟生物：凝胶膜过滤是基于分子大小和形状差异的液相层析分离技术，核心原理是利用多孔凝胶的分子筛效应：小分子可进入凝胶颗粒的孔隙中，在柱内停留时间长、洗脱体积大；大分子无法进入孔隙，随流动相快速流出，洗脱体积小，从而实现不同分子量物质的分离。该方法温和、不改变物质天然构象，广泛用于蛋白质、多糖、核酸等生物大分子的分离、纯化、脱盐和分子量测定。
一、核心材料与试剂
1、洗脱液（流动相）
要求温和、不与样品/凝胶反应、维持样品天然结构，常用：
中性缓冲液：PBS（0.01~0.05 mol/L，pH 7.0~7.4）、Tris-HCl（0.05 mol/L，pH 7.5~8.0），适用于蛋白质/核酸；
纯水/低盐溶液：适用于多糖脱盐；
注意：洗脱液需经0.22 μm 滤膜过滤并脱气，避免凝胶柱产生气泡，影响分离效果。
2、辅助试剂与耗材
层析柱（玻璃/不锈钢，规格根据上样量选择：柱高/柱径比一般为 10:1~30:1，柱高越高分辨率越好）；
恒流泵、紫外检测器、收集器（层析系统）；
烧杯、玻璃棒、漏斗、滤膜、离心管、移液管等；
平衡液（与洗脱液一致）、样品缓冲液（与洗脱液一致，避免样品变性/沉淀）。
二、实验操作流程（经典柱层析法，最常用）
全程遵循无菌、无气泡、温和操作原则，防止凝胶破碎和样品失活，步骤分为凝胶预处理→装柱→柱平衡→上样→洗脱→收集与检测→柱再生与保存。
1、凝胶预处理
目的是使凝胶充分溶胀，去除杂质、细颗粒，保证柱床均匀。
称量与溶胀：按层析柱体积（一般凝胶床体积占柱容积的 80%）称量干凝胶，加入过量洗脱液/纯水，室温或水浴溶胀（葡聚糖凝胶 G-25 室温溶胀 2~4 h，G-200 需室温溶胀 24 h 或沸水浴溶胀 1 h，缩短溶胀时间且避免结块）；
脱气：溶胀后的凝胶悬液超声脱气 5~10 min，或抽真空脱气，去除内部气泡；
除杂与过筛：凝胶悬液静置后，倾去上层浮液（含细颗粒、杂质），用洗脱液反复洗涤 2~3 次，也可通过纱布/尼龙网过筛，去除细颗粒（细颗粒会堵塞柱床，降低流速）。
2、装柱（关键步骤，直接影响分辨率）
核心是一次性装柱、柱床均匀、无气泡、无断层，分为湿法装柱（最常用）和干法装柱（仅适用于少数凝胶），此处介绍湿法装柱：
层析柱准备：将层析柱垂直固定在支架上，柱内加入 1/3 体积的洗脱液，打开柱下端出口，使洗脱液缓慢流出，排出柱内和出口处的气泡；
装柱：将溶胀好的凝胶悬液搅拌均匀，沿柱壁缓慢倒入（避免产生气泡），倒至凝胶床达到预定高度（柱高/柱径比≥10:1）；
沉降与压实：关闭柱下端出口，让凝胶自然沉降 30~60 min，然后打开出口，用洗脱液以低流速（0.5~1 mL/min） 冲洗柱床，使凝胶压实（压实后的柱床应平整、无断层、无气泡）；
检查柱床：若柱床出现断层、气泡，需倒出凝胶重新装柱。
3、柱平衡
目的是使凝胶柱床的离子强度、pH 与洗脱液一致，保证样品分离的稳定性。
用与洗脱液一致的平衡液以1~2 倍柱床体积（CV） 的量，在恒定流速下冲洗凝胶柱（流速与后续洗脱一致）；
平衡至柱出口的 pH、电导率与平衡液完全一致（可通过 pH 计、电导率仪检测），且柱床高度稳定（无塌陷、无膨胀）。
4、上样（核心原则：低体积、高浓度、慢上样）
上样体积直接影响分辨率，上样体积越小，分辨率越高，一般上样体积为柱床体积的 1%~5%（分析级分离）或 5%~10%（制备级分离）。
样品预处理：样品用样品缓冲液溶解，经0.22 μm 滤膜过滤或 10000 r/min 离心 10 min，去除沉淀和不溶性杂质，避免堵塞柱床；样品浓度控制在 1~5 mg/mL（蛋白质），避免浓度过高导致分子间相互作用，影响分离；
上样操作：
打开柱下端出口，使柱床表面的洗脱液恰好与凝胶表面平齐（切勿干柱，凝胶干缩会导致柱床破裂），关闭出口；
用移液管沿柱壁缓慢滴加样品（避免冲散凝胶床表面），样品加完后，打开出口，使样品缓慢渗入凝胶柱；
待样品完全渗入凝胶床后，加入少量洗脱液，冲洗柱壁上的样品，待洗脱液渗入凝胶床后，再加入足量洗脱液至柱内液面高度。
5、洗脱
核心是恒定流速、连续洗脱，保证分子按分子量大小依次流出。
洗脱条件：洗脱液与平衡液一致，流速恒定（根据凝胶类型选择：葡聚糖凝胶 G-25 流速 1~2 mL/min，G-200 流速 0.5~1 mL/min；琼脂糖凝胶流速可适当提高），流速过快会导致分离峰重叠，过慢会增加实验时间且可能导致样品扩散；
洗脱方式：采用等度洗脱（单一洗脱液，无需改变 pH 和离子强度），凝胶过滤一般无需梯度洗脱，因分离仅依赖分子筛效应；
柱内液面：洗脱过程中，柱内洗脱液液面需始终高于凝胶床表面2~3 cm，防止干柱。
6、收集与检测
收集：用自动部分收集器按固定体积（1~5 mL /管） 收集洗脱液，记录每管的收集序号；
检测：根据待分离物质的性质选择检测方法，实时检测各管洗脱液的目标物含量：
蛋白质：紫外分光光度法（A280 nm）；
核酸：紫外分光光度法（A260 nm）；
多糖：苯酚 - 硫酸法、蒽酮 - 硫酸法；
小分子杂质（如盐）：电导率仪、硝酸银法（检测 Cl⁻）；
绘制洗脱曲线：以收集管序号（或洗脱体积）为横坐标，检测吸光度（或浓度） 为纵坐标，绘制洗脱曲线，出现的吸收峰即为不同分子量的物质，目标峰对应的洗脱液即为纯化的样品。
7、柱再生与保存
目的是去除柱内残留的样品和杂质，延长凝胶使用寿命，保存后可反复使用。
（1）柱再生
用2~3 倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶柱，去除柱内残留的样品；
若柱床有蛋白吸附（凝胶轻微吸附），可用0.5 mol/L NaCl 溶液冲洗，再用洗脱液平衡至中性；
若柱床污染严重，可用70% 乙醇或0.5% 次氯酸钠溶液冲洗，再用大量洗脱液平衡，恢复凝胶活性。
（2）凝胶保存
短期保存（1~2 周）：凝胶柱保持湿润，柱内加入洗脱液，密封柱两端，4℃冷藏，避免反复冻融；
长期保存（数月）：将凝胶从柱内倒出，用洗脱液洗涤 2~3 次，加入0.02% 叠氮钠（NaN₃） 或70% 乙醇（抑菌剂），悬浮后 4℃冷藏；
干凝胶保存：若需长期保存干凝胶，将凝胶用纯水洗涤后，室温晾干，密封保存于干燥处。
三、特殊操作：脱盐与小分子去除
凝胶过滤是生物大分子脱盐的常用方法，选择葡聚糖凝胶 G-25（分级范围 1000~5000，蛋白质分子无法进入孔隙，盐分子可进入），操作简化，核心要点：
上样体积可适当提高（为柱床体积的 20%~30%），提高脱盐效率；
洗脱液用纯水或目标缓冲液，流速 1~2 mL/min；
检测：蛋白质在 A280 nm 有吸收峰，盐分子无吸收峰，收集蛋白质峰即可得到脱盐后的样品，脱盐率可达 95% 以上。
四、分子量测定
利用凝胶过滤的洗脱体积与分子量的对数呈线性关系，可测定未知生物大分子的分子量：
标准曲线制作：选择 3~5 种已知分子量的球形蛋白标准品，在相同层析条件下上样，测定各标准品的洗脱体积（Ve）；
计算相对洗脱体积（Kav）：Kav=(Ve−Vo)/(Vt−Vo)，其中Vo为外水体积（完全排阻的大分子的洗脱体积，如蓝色葡聚糖 2000），Vt为柱床总体积；以logMW（分子量的对数） 为纵坐标，Kav 为横坐标，绘制标准曲线；未知样品测定：在相同条件下测定未知样品的Ve，计算Kav，根据标准曲线查得对应的 logMW，换算得到分子量。
注意：该方法仅适用于球形蛋白，非球形蛋白的测定结果会有偏差，需校正。
五、关键质量控制与注意事项（QC 要点）
1、实验前质控
凝胶填料：检查保质期，确认无潮解、结块、污染；
洗脱液/缓冲液：现配现用，过滤脱气，检测 pH、电导率是否符合要求；
层析柱：检查密封性，确保无漏液，出口无堵塞。
2、实验过程质控
柱床质量：全程保证柱床垂直、均匀、无气泡、无断层、不干柱，否则重新装柱；
流速控制：洗脱过程中流速恒定，避免忽快忽慢，导致峰形展宽、重叠；
样品预处理：必须去除沉淀和细颗粒，防止堵塞柱床；样品浓度适中，避免分子间相互作用；
温度控制：一般室温（20~25℃）操作，对温度敏感的样品可在 4℃下进行低温层析。
3、实验后质控
洗脱曲线：目标峰应对称、无拖尾、与杂质峰完全分离，若峰形展宽，可能是上样体积过大、流速过快或柱床不均匀；
样品活性：检测纯化后样品的生物活性，确保凝胶过滤过程未导致样品失活；
凝胶再生：再生后的凝胶柱需重新平衡，检测柱床流速和分辨率，与新柱一致方可再次使用。
六、应用领域
生物大分子纯化：蛋白质（酶、抗体、重组蛋白）、多糖、核酸（DNA、RNA）、多肽的分离纯化，获得高纯度天然活性样品；
脱盐与小分子去除：生物大分子溶液脱除无机盐、有机溶剂、小分子杂质；
分子量测定：球形蛋白、多糖等大分子的分子量快速测定（相对误差 ±5%~±10%）；
样品浓缩：通过凝胶过滤将稀样品溶液浓缩（选择合适凝胶，使样品分子被排阻，洗脱体积小，浓度提高）；
蛋白复合物与寡聚体分析：分析蛋白质的天然聚集体，因复合物分子量远大于单体，可有效分离。
七、技术优缺点
1、优点
温和性：分离条件温和，不使用有机溶剂、高盐、强酸强碱，可保持样品的天然构象和生物活性；
通用性：仅依赖分子大小，无需样品与凝胶的特异性结合，适用于大多数生物大分子；
操作简单：无需复杂的梯度洗脱系统，等度洗脱即可，实验重复性好；
可规模化：从分析级（微量样品）到制备级（大量样品），均可通过调整层析柱规格实现，适合实验室和工业生产。
2、缺点
分辨率有限：仅能分离分子量差异较大（≥2 倍）的物质，对分子量相近的物质分离效果差；
上样量小：为保证分辨率，上样体积一般≤5% 柱床体积，制备效率较低；
实验时间较长：流速较慢，尤其是大孔径凝胶，分离一次需数小时甚至数十小时；
凝胶成本较高：高品质凝胶价格昂贵，且部分凝胶机械强度低，易破碎。
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