结晶紫中性红胆盐肉汤的核心原理与使用方法及应用范围！
小杨 / 2026-01-30 09:55:55
结晶紫中性红胆盐肉汤（Violet Red Bile Agar Broth，简称 VRBA 肉汤，也常称胆盐乳糖肉汤的改良型/选择性增菌型）是食品微生物检测中用于大肠菌群选择性增菌、计数的核心培养基，属于选择性和鉴别性液体培养基，国标中常用于食品中大肠菌群的初发酵、增菌培养，也是平板计数法的预增菌基础，核心适配 GB 4789.3 等食品微生物检测标准。
一、核心原理
该培养基通过选择性抑制杂菌 + 鉴别目标菌的双重机制实现大肠菌群的筛选，各组分功能协同作用，具体如下：
1、选择性组分：胆盐 + 结晶紫
胆盐（常用牛胆盐或猪胆盐）：抑制革兰氏阳性菌（如
葡萄球菌、
芽孢杆菌、
乳酸菌等）的生长，仅允许革兰氏阴性菌繁殖；
结晶紫：作为革兰氏阳性菌的强效抑制剂，进一步提升选择性，避免杂菌对大肠菌群检测的干扰，同时对部分非大肠菌群的革兰氏阴性菌也有轻度抑制作用。
2、鉴别组分：乳糖 + 中性红
中性红：酸碱指示剂，pH 变色范围 6.8~8.0，酸性条件下（pH<6.8）呈红色/桃红色，碱性/中性条件下为无色/淡黄色。大肠菌群发酵乳糖产酸使培养基 pH 下降，中性红显色，是判断大肠菌群存在的核心依据。
3、营养与渗透压组分
蛋白胨、酵母膏提供氮源、维生素、生长因子，维持细菌正常代谢；氯化钠调节培养基渗透压，保证细菌生长的理化环境。
核心判定逻辑：培养基中出现浑浊 + 红色/桃红色变色，说明有能发酵乳糖产酸的革兰氏阴性菌（大肠菌群）生长；无浑浊、培养基保持原色（淡黄色/无色），则为阴性。
二、培养基配方（国标经典配方，1L）
基础配方为定量溶解后调 pH 至 7.4±0.1，121℃高压灭菌 15min，各组分含量如下：
蛋白胨：7.0g
酵母膏：3.0g
乳糖：10.0g
牛胆盐（或猪胆盐）：1.5g
氯化钠：5.0g
结晶紫：0.002g（2mg）
中性红：0.03g（30mg）
蒸馏水：1000mL
注：结晶紫和中性红为微量指示剂，需单独溶解后加入，避免直接混合结块；胆盐不可高温久煮，灭菌时间严格控制 15min，防止失效。
三、使用方法（适配食品微生物大肠菌群检测，GB 4789.3）
（一）前期准备：培养基配制与灭菌
按配方称取各组分，加入蒸馏水，加热搅拌至完全溶解（避免煮沸，防止乳糖分解）；
用 1mol/L HCl 或 NaOH 调节 pH 至7.4±0.1（25℃）；
分装至试管/三角瓶（试管可装 10mL /支，三角瓶按需分装），加塞、包扎；
121℃高压蒸汽灭菌 15min，灭菌后迅速取出，冷却至 37℃左右备用，培养基冷却后应无沉淀、无变色，呈淡黄色透明状。
（二）样品接种与培养（分液体样品和固体/半固体样品，核心为初发酵试验）
1、固体/半固体样品（如肉类、糕点、乳制品、蔬菜等）
称取25g 样品，放入无菌均质袋中，加入 225mL 无菌生理盐水/磷酸盐缓冲液，用无菌均质器均质 1~2min，制成1:10 的样品匀液；
用无菌移液管吸取 1mL 1:10 匀液，接种至 10mL VRBA 肉汤试管中（也可根据样品污染程度，接种 10mL 匀液至 90mL VRBA 肉汤三角瓶中，即十倍稀释）；
若样品污染度未知，可做系列稀释（10⁻¹、10⁻²、10⁻³ 等），各稀释度分别接种 1mL 至 VRBA 肉汤，避免过度生长导致判断误差。
2、液体样品（如饮用水、饮料、酱油、醋等）
清澈液体：直接用无菌移液管吸取1mL 样品，接种至 10mL VRBA 肉汤试管中；
浑浊液体：先做 1:10 稀释后，再接种 1mL 稀释液，操作同固体样品。
3、培养条件
将接种后的 VRBA 肉汤试管/三角瓶置于36±1℃ 恒温培养箱中，培养24±2h；若培养 24h 无明显反应，可继续培养至 48h（国标以 24h 为主要判定时间，48h 为补充）。
（三）结果观察与判定（初发酵结果）
培养结束后，观察培养基的浑浊度和颜色变化，核心判定标准如下：
培养现象 结果判定 后续操作
培养基浑浊，且呈红色/桃红色（整管或局部） 初发酵阳性 取阳性培养液，划线接种至结晶紫中性红胆盐平板，进行分离培养和复发酵试验，确认大肠菌群
培养基无浑浊，保持淡黄色透明状 初发酵阴性 无需后续操作，判定该稀释度下无大肠菌群生长
培养基浑浊，但未变色（仍为淡黄色） 初发酵可疑 继续培养至 48h，若仍不变色则判定为阴性；若变色则按阳性处理
关键注意点：仅浑浊无红色，说明有非乳糖发酵的革兰氏阴性菌生长，并非大肠菌群，需排除；轻微浑浊但明显红色，仍判定为阳性（低浓度大肠菌群生长）。
（四）复发酵试验（确认大肠菌群，国标必做）
从 VRBA 平板上挑取3~5 个典型菌落（典型菌落为红色、圆形、凸起、周围有红色晕圈，直径 2~3mm）；
将典型菌落分别接种至乳糖胆盐发酵管中，36±1℃培养 24±2h；
若乳糖胆盐发酵管出现产酸（培养基变黄）+ 产气（杜氏小管有气泡），则复发酵阳性，确认该菌落为大肠菌群；按阳性菌落数计算样品中大肠菌群含量。
四、质量控制（QC，实验室必备，避免假阳性/假阴性）
1、无菌性检查
取制备好的 VRBA 肉汤 5~10mL，置于 36±1℃培养 24h，培养基应无浑浊、无菌落生长，否则判定为灭菌不合格，废弃。
2、阳性对照
3、阴性对照
接种
金黄色葡萄球菌 ATCC 25923（革兰氏阳性菌）至 VRBA 肉汤，36±1℃培养 24~48h，应无浑浊、无生长，证明选择性有效；若出现生长，说明胆盐/结晶紫失效，需重新配制培养基。
4、培养基稳定性
配制好的 VRBA 肉汤应在 2~8℃冷藏保存，保质期不超过 7d；冷藏后若出现沉淀、变色、浑浊，不可使用。
五、注意事项
无菌操作：全程在无菌超净工作台中进行，避免环境杂菌污染，尤其是革兰氏阴性菌，防止假阳性；
胆盐与结晶紫：胆盐品牌/批次对选择性影响大，建议使用国标指定品牌；结晶紫浓度不可过高（超过 2mg/L），否则会抑制大肠菌群本身生长，导致假阴性；
样品稀释：样品匀液制备后应在 30min 内接种，避免细菌死亡；稀释液需现配现用，无菌验证合格；
培养温度：严格控制 36±1℃，温度过高（>38℃）会抑制大肠菌群生长，温度过低（<35℃）会导致生长缓慢，影响判定；
结果判断：避免将“培养基轻微泛红但无浑浊”判定为阳性，该现象可能是指示剂吸附，并非细菌产酸；
安全操作：结晶紫为碱性染料，有轻微刺激性，操作时戴手套；培养基灭菌后冷却至室温再接触，防止烫伤。
六、应用范围
主要用于食品、食品原料、食品加工环境样品中的大肠菌群初发酵增菌和筛选，是食品微生物安全检测的基础方法；也可用于饮用水、化妆品等样品的大肠菌群初步检测，但需根据对应国标调整接种量和培养条件。
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