人原代乳腺成纤维细胞分离与培养的标准化操作流程！
小杨 / 2026-01-27 09:35:21

 

人原代乳腺成纤维细胞的分离与培养标准化操作流程适用于从人乳腺组织样本中分离、纯化并培养原代乳腺成纤维细胞，核心分为组织预处理与消化、细胞分离与纯化、原代培养与传代、质量控制四个关键环节，操作需在无菌环境下进行。
 
一、实验准备
 
1、试剂与耗材
 
基础试剂：PBS 缓冲液（不含钙镁离子）、0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化液、Ⅰ 型胶原酶、含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM/F12 培养基、双抗（青霉素 100 U/mL + 链霉素 100 μg/mL）、红细胞裂解液（可选）。
 
耗材：无菌手术器械（剪刀、眼科剪）、60 mm/100 mm 细胞培养皿、离心管、滤网（100 μm、70 μm）、细胞培养瓶。
 
2、实验环境
 
超净工作台紫外消毒 30 min，手术器械高压灭菌后酒精擦拭，再经酒精灯火焰灭菌冷却备用。
 
细胞培养箱提前预热至 37℃、5% CO₂、饱和湿度。
 
二、组织样本预处理
 
取新鲜人乳腺组织样本（临床手术切除标本，需经伦理审批），迅速转移至含双抗的无菌 PBS 中，冰上运输至实验室。
 
在超净台内，将组织转移至无菌培养皿中，用 PBS 反复冲洗 3 - 5 次，去除血液、脂肪及坏死组织。
 
用无菌眼科剪将组织剪切成 1 mm³ 左右的小块，过程中可滴加少量 PBS 保持组织湿润，避免组织干燥。
 
三、组织消化与细胞分离
 
采用两步消化法（先胶原酶消化组织块，后胰酶消化单细胞），提高成纤维细胞得率。
 
1、Ⅰ 型胶原酶消化
 
将剪碎的组织块转移至 50 mL 离心管中，加入 5 - 10 倍体积的 0.1% Ⅰ 型胶原酶溶液（用 DMEM/F12 配制，含双抗）。
 
37℃恒温摇床孵育 2 - 4 h，期间每隔 30 min 轻轻颠倒离心管一次，促进组织解离。
 
消化至组织块松散、溶液浑浊时，加入含 10% FBS 的培养基终止消化。
 
2、过滤与离心收集细胞
 
依次用 100 μm 和 70 μm 细胞滤网过滤消化液，去除未消化的组织残渣，收集滤液至新离心管。
 
1000 r/min 离心 5 min，弃上清；若细胞沉淀中红细胞较多，加入红细胞裂解液室温处理 5 min，再用 PBS 洗涤 1 次。
 
3、胰酶二次消化纯化（可选，去除上皮细胞）
 
细胞沉淀用 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 重悬，37℃孵育 5 - 8 min（成纤维细胞抗胰酶消化能力强于上皮细胞）。
 
镜下观察到少量细胞变圆时，立即加入含血清培养基终止消化，1000 r/min 离心 5 min，弃上清。
 
四、原代细胞接种与培养
 
1、细胞接种
 
用含 10% FBS、1% 双抗的 DMEM/F12 培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度至 1×10⁵ - 2×10⁵ cells/mL。
 
将细胞悬液接种至细胞培养瓶中，置于 37℃、5% CO₂培养箱培养。
 
2、首次换液与纯化
 
接种后 24 - 48 h 进行首次换液，弃去未贴壁的细胞（多为上皮细胞、免疫细胞等杂细胞），补充新鲜完全培养基。
 
成纤维细胞贴壁速度快，呈梭形伸展；上皮细胞多呈铺路石样，若杂细胞较多，可通过差速贴壁法进一步纯化：换液后继续培养 2 h，成纤维细胞优先贴壁，轻轻吹打悬浮细胞弃去，保留贴壁的成纤维细胞。
 
3、常规培养与观察
 
后续每 2 - 3 d 换液一次，每次更换 1/2 - 2/3 体积新鲜培养基。
 
镜下观察细胞生长状态：原代乳腺成纤维细胞为梭形或星形，胞核清晰，呈放射状或漩涡状生长，5 - 7 d 可达到 80% - 90% 融合。
 
五、细胞传代
 
当细胞融合度达 80% - 90% 时进行传代，吸弃培养瓶内培养基，用无菌 PBS 洗涤细胞表面 2 次，去除残留血清。
 
加入适量 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA，覆盖细胞表面即可，37℃孵育 2 - 5 min，镜下观察到细胞变圆、间隙增大时，立即加入含血清培养基终止消化。
 
用移液管轻轻吹打瓶壁，使细胞完全脱落，收集细胞悬液至离心管，1000 r/min 离心 5 min。
 
弃上清，用新鲜完全培养基重悬细胞沉淀，按 1:2 - 1:3 的比例接种至新培养瓶，补充培养基后放回培养箱继续培养。
 
注意：原代乳腺成纤维细胞传代不超过 5 代，3 代以内细胞活力和功能最佳，适合后续实验。
 
六、质量控制与鉴定要点
 
无菌检测：培养过程中每日观察培养基是否浑浊，若出现细菌/真菌污染，立即丢弃污染细胞。
 
细胞纯度鉴定：采用免疫荧光染色法，成纤维细胞特异性标志物为波形蛋白，上皮细胞标志物为细胞角蛋白，纯度需达到 90% 以上。
 
细胞活力检测：台盼蓝染色法检测细胞活力，原代细胞活力应≥85%。
 
七、常见问题及解决方案
 
问题            原因      解决方案
 
细胞贴壁率低  组织消化过度/胰酶作用时间过长；培养基血清质量差  缩短胶原酶和胰酶消化时间；更换优质胎牛血清
 
杂细胞（上皮细胞）过多  差速贴壁纯化不充分  增加差速贴壁次数；利用成纤维细胞抗胰酶特性，延长胰酶二次消化时间 1 - 2 min
 
细胞生长缓慢  培养箱 CO₂浓度不足；细胞接种密度过低  校准培养箱 CO₂浓度至 5%；提高接种密度至 2×10⁵ cells/mL
 
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