NAC 琼脂培养基的标准化操作流程及核心注意事项！
小杨 / 2026-01-21 09:34:59
NAC 琼脂培养基全称为nystatin–amphotericin B–chloramphenicol agar，是一种选择性培养基，主要通过添加制霉菌素、两性霉素 B 和氯霉素三种抑菌剂，抑制真菌、革兰氏阴性菌生长，专门用于食品、临床样本等基质中革兰氏阳性菌（尤其是
葡萄球菌、
链球菌）的分离和纯化。
一、标准用法（实验室标准化操作流程）
1、培养基的复溶与灭菌
称量与溶解：按照培养基说明书比例（通常每 1000mL 蒸馏水加 40-45g NAC 琼脂干粉），将干粉加入去离子水或蒸馏水，搅拌均匀。
加热煮沸：将混合液置于电炉或微波炉中加热至完全沸腾溶解，过程中需不断搅拌，防止培养基烧焦或沸腾溢出。
灭菌处理：溶解后迅速分装至锥形瓶或培养皿，采用 121℃、103.4kPa 高压蒸汽灭菌 15 分钟。
冷却与倾注平板：灭菌后待培养基温度降至 50-55℃（此时培养基不烫手，且抑菌剂不易被破坏），在无菌超净台内倾注无菌培养皿，每皿约 15-20mL，静置冷却凝固。
2、样本接种与培养
样本处理：根据样本类型进行梯度稀释，制备合适浓度的菌悬液。
接种方式
涂布法：取 0.1mL 稀释后的菌悬液，滴加在 NAC 琼脂平板表面，用无菌 L 型玻棒均匀涂布。
划线法：直接用接种环蘸取样本或菌悬液，在平板上进行分区划线，用于单菌落分离。
培养条件：将接种后的平板倒置，置于 35-37℃ 恒温培养箱中，需氧培养 24-48 小时。
3、结果观察与后续鉴定
培养结束后，观察平板上菌落的形态、大小、颜色、边缘特征等。
挑取典型单菌落，进行革兰氏染色、生化鉴定（如血浆凝固酶试验、触酶试验）或分子生物学鉴定，确认目标菌株。
二、核心注意事项
1、培养基配制的关键要点
抑菌剂稳定性：制霉菌素、两性霉素 B 对温度敏感，若培养基为干粉预混抑菌剂，灭菌时需严格控制温度和时间，避免抑菌剂失效；若为单独添加抑菌剂，需在培养基冷却至 50-55℃时无菌操作加入，摇匀后再倾注平板。
pH 值校准：灭菌前需将培养基 pH 值调至 7.0-7.2（符合革兰氏阳性菌生长需求），pH 过高或过低会抑制目标菌生长，可用 1mol/L HCl 或 NaOH 调节。
避免反复灭菌：培养基只能高压灭菌 1 次，反复灭菌会导致琼脂凝固能力下降、抑菌剂失效，同时产生有害物质。
2、无菌操作要求
培养基倾注、样本接种全过程需在超净台内完成，操作人员需严格执行无菌操作规范，防止杂菌污染。
灭菌后的培养皿、接种工具需干燥后使用，避免冷凝水影响菌落生长和观察。
3、样本与培养的注意事项
样本稀释梯度：根据样本中菌浓度预估，设置合理稀释梯度，避免平板菌落数过多（>300CFU /皿）或过少（<30CFU /皿），确保计数结果准确。
培养时间控制：培养时间不宜超过 48 小时，否则非目标菌可能因抑菌剂失效而缓慢生长，干扰结果判断；若为缓慢生长菌株，可适当延长至 72 小时，但需结合菌落形态综合判断。
阴性对照设置：每次实验需设置空白对照平板（不接种样本），同步培养，用于监测培养基和操作过程是否存在污染。
4、储存与有效期
干粉储存：未开封的 NAC 琼脂干粉需置于 2-25℃、干燥、避光 环境中储存，避免受潮、阳光直射。
成品平板储存：倾注好的平板需密封后置于 2-8℃ 冷藏，有效期不超过 7 天，使用前需恢复至室温，检查平板是否有污染、干裂或冷凝水过多等情况，不合格平板禁止使用。
5、安全与废弃物处理
操作过程中需佩戴手套、口罩和实验服，避免培养基接触皮肤和黏膜；氯霉素具有一定毒性，需避免吸入或误食。
实验后的培养基、接种工具需经 121℃高压灭菌 30 分钟 灭活后，再按照实验室生物安全规范进行处理。
三、常见问题及解决方案
常见问题 可能原因 解决方案
平板无菌落生长 1.抑菌剂浓度过高；2.培养条件不适宜；3.样本中无目标菌 1.核对抑菌剂添加量，必要时降低浓度；2.确认培养温度和有氧环境；3.更换样本或调整稀释梯度
杂菌过度生长 1.抑菌剂失效；2.灭菌不彻底；3.操作污染 1.检查培养基有效期，重新配制并严格控制灭菌参数；2.加强无菌操作，设置空白对照
菌落形态不典型 1.培养时间过长；2.pH 值异常 1.严格控制培养时间在 24-48 小时；2.灭菌前校准培养基 pH 值
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