小鼠肝动脉平滑肌细胞分离与培养的标准化操作流程！
小杨 / 2026-01-20 09:58:39
小鼠肝动脉平滑肌细胞是构成小鼠肝动脉血管壁的重要细胞类型之一，本方法采用胰蛋白酶、胶原酶联合消化法结合差速贴壁法，可高效获取高纯度的小鼠肝动脉平滑肌细胞，适用于实验室常规原代细胞分离，操作中需严格遵循无菌原则。
一、实验准备
1、实验材料
实验动物：6-8 周龄 SPF 级小鼠（雌雄均可，体重 18-22g），适应性喂养 1 周。
2、试剂配制
预冷 PBS 缓冲液（不含钙镁离子）：含 100U/mL 青霉素 + 100μg/mL 链霉素。
消化液：0.25% 胰蛋白酶（含 0.02% EDTA）与 0.1%Ⅰ 型胶原酶按体积比 1:1 混合，现配现用，用 0.22μm 滤膜过滤除菌。
完全培养基：DMEM/F12 培养基 + 10% 胎牛血清（FBS，灭活）+5ng/mL 血小板衍生生长因子（PDGF-BB）+100U/mL 青霉素 + 100μg/mL 链霉素。
实验器材：无菌手术器械（眼科剪、眼科镊、血管钳）、细胞培养皿/瓶、离心管、超净工作台、CO₂培养箱、倒置显微镜。
3、预处理
实验前 1 天，将完全培养基置于 37℃水浴预热；手术器械高压灭菌后，置于超净工作台紫外照射 30min。
小鼠颈椎脱臼处死，75% 乙醇浸泡全身消毒 5min，转移至超净工作台。
二、原代细胞分离步骤
1、肝动脉组织取材
无菌操作打开小鼠腹腔，暴露肝脏及肝十二指肠韧带，用眼科镊分离出肝固有动脉（肝总动脉分支，伴行门静脉和胆总管），剔除周围结缔组织和脂肪组织。
用预冷无菌 PBS 反复冲洗动脉组织，去除残留血液，将动脉剪成 1-2mm³ 的小块。
2、联合酶消化
将组织块转移至无菌离心管，加入 5mL 预冷的混合消化液，37℃水浴振荡消化 30-40min，期间每 10min 轻轻颠倒离心管 1 次。
镜下观察，当组织块边缘变模糊、出现少量悬浮细胞时，立即加入 2mL 完全培养基终止消化。
用 100 目细胞筛网过滤细胞悬液，去除未消化的组织碎片，收集滤液至新的离心管。
3、离心与重悬
细胞悬液以 1000r/min 离心 5min，弃上清；加入 2mL 完全培养基，轻轻吹打沉淀，重悬细胞。
4、差速贴壁纯化
将重悬的细胞接种至细胞培养瓶，置于 37℃、5% CO₂培养箱中孵育 1.5h。
此时成纤维细胞等杂细胞优先贴壁，而肝动脉平滑肌细胞贴壁较慢，轻轻吸出未贴壁的细胞悬液。
将吸出的细胞悬液接种至新的培养瓶，加入完全培养基，继续培养。
三、细胞培养与传代
1、原代培养
接种后 24h，观察细胞贴壁情况，此时可见少量梭形细胞贴壁；48h 后更换一次完全培养基，去除未贴壁的死细胞。
后续每 2-3 天换液一次，当细胞融合度达到 80%-90% 时，即可进行传代。
2、传代培养
弃去旧培养基，用预冷 PBS 冲洗细胞 2 次，去除残留血清。
加入适量 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液，覆盖细胞表面，37℃孵育 1-2min。
倒置显微镜下观察，当细胞收缩变圆、间隙增大时，立即加入完全培养基终止消化。
用无菌吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落形成单细胞悬液。
细胞悬液 1000r/min 离心 5min，弃上清，完全培养基重悬细胞。
按 1:2 的比例接种至新的培养瓶，补充完全培养基，置于培养箱继续培养。
注意：小鼠肝动脉平滑肌细胞原代可传 3-5 代，超过 5 代后细胞易发生表型转化（收缩型→合成型），建议使用 P3 代以内的细胞进行实验。
四、质量控制与鉴定
形态学鉴定：倒置显微镜下观察，纯化后的细胞呈典型梭形或纺锤形，细胞密集生长时可形成峰 - 谷状排列，为平滑肌细胞特征性形态。
免疫荧光鉴定：取对数生长期细胞，爬片固定后，用 α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）一抗孵育，荧光二抗显色，阳性率≥90% 即为高纯度细胞。
污染检测：培养过程中观察细胞形态，若出现培养基浑浊、细胞形态异常，需进行支原体、细菌、真菌检测，确保细胞无污染。
五、常见问题与避坑指南
1、组织消化过度/不足
不足：组织块未散开，细胞产量低；解决：延长消化时间至 45min，或提高胶原酶浓度至 0.15%。
过度：细胞碎片多，存活率低；解决：缩短消化时间，或降低胰蛋白酶浓度至 0.125%。
2、杂细胞污染（成纤维细胞、内皮细胞）
原因：组织取材时未剔除干净结缔组织，或差速贴壁时间不足；解决：严格剔除动脉周围组织，差速贴壁时间延长至 2h。
3、细胞增殖缓慢
原因：血清质量差、缺乏生长因子；解决：选用优质胎牛血清，在完全培养基中添加 PDGF-BB 或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
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