单增李斯特菌的溶血试验与协同溶血试验的注意事项！
小杨 / 2025-12-29 10:19:52
一、溶血试验（自身溶血）的注意事项
溶血试验是初筛步骤，主要观察
单增李斯特菌是否产生溶血素 LLO，形成特定的 β 溶血圈。
1、培养基的选择与制备
血液来源与质量：必须使用新鲜的羊血。陈旧的羊血会导致红细胞破裂，影响溶血圈的观察。血液与培养基的比例通常为 5-10%（v/v）。
平板状态：使用前检查平板是否有污染、干裂或变色。平板应在 4℃冷藏保存不超过 3 天，且需在室温下平衡至与环境温度一致（约 15-25 分钟）再进行接种，以避免冷凝水影响菌落生长和溶血圈形成。
无菌操作：制备和接种过程中严格遵守无菌操作规范，防止杂菌污染。
2、菌株的准备
纯培养物：使用新鲜的、纯培养的单菌落进行接种。陈旧培养物或不纯的菌落可能导致结果不准确。最好使用在胰酪大豆胨琼脂（TSA）或脑心浸液琼脂（BHI）上 36±1℃培养 18-24 小时的菌株。
菌液浓度：挑取的菌量要适中，以能形成一个小的、清晰的菌落为宜。通常用接种环尖端挑取单个菌落。
3、接种方法
穿刺接种：使用接种针或接种环的尖端，从平板表面垂直刺入琼脂约 2/3 深度，到达接近平板底部但不触及底部的位置，然后沿原穿刺线拔出。穿刺深度要一致，以确保不同菌株的溶血圈大小具有可比性。
避免损伤：穿刺时动作要轻柔，避免在琼脂中划出多余的划痕或损伤琼脂表面，以免影响菌落生长和溶血圈的形态。
4、培养条件
温度：标准培养温度为36±1℃。温度过高（如 37-38℃）可能抑制溶血素 LLO 的产生，导致溶血圈不明显或消失；温度过低（如 30℃以下）则可能影响细菌生长。
时间：培养时间通常为24-48 小时。培养时间不足，溶血素产生量少，溶血圈不清晰；时间过长，溶血素可能被细菌自身分解，或其他杂菌的生长可能干扰观察。
气体环境：通常为需氧条件。
5、结果观察与判读
观察时机：在培养时间结束后，立即在明亮处观察平板。
判读标准：
β 溶血：菌落周围出现清晰、透明、界限分明的亮区，这是单增李斯特菌的典型特征。
与其他李斯特菌的区别：
伊氏李斯特菌 (L. ivanovii)：通常表现为宽的、模糊的 β 溶血圈。
斯氏李斯特菌 (L. seeligeri)：可能表现为弱的 β 溶血。
对照设置：每次实验都应设置阳性对照（如已知的
单增李斯特菌标准株）和阴性对照（如已知的
英诺克李斯特菌标准株），以确保实验系统的可靠性。
6、其他注意事项
污染排查：如果平板上出现杂菌生长，应视为无效实验，需重新进行。
结果记录：详细记录溶血圈的大小、形态、颜色等特征。
二、协同溶血试验（CAMP 试验）的注意事项
CAMP 试验是确证试验，利用金葡菌产生的 β 溶血素（SLO）与
单增李斯特菌的 LLO 协同作用，在两菌划线之间形成一个独特的箭头状或扇形溶血增强区。
1、培养基的选择与制备
与溶血试验相同：同样要求使用新鲜的羊血琼脂平板，并确保血液质量良好、平板状态正常。
2、菌株的准备
待测菌：使用新鲜的、纯培养的单菌落。
指示菌（金葡菌/马红球菌）：
金葡菌 (Staphylococcus aureus,
ATCC 25923)：是标准的指示菌，其产生的 β 溶血素（SLO）活性稳定，能有效增强单增李斯特菌的溶血。
马红球菌 (Rhodococcus equi,
ATCC 33270)：有时也用于增强伊氏李斯特菌的溶血。
指示菌必须新鲜：应使用在血琼脂平板上 36±1℃培养 18-24 小时的新鲜培养物，以保证其 β 溶血素的活性。
3、接种方法
划线方式：
在平板中央，用接种环以平行划线的方式，分别划两条线，间距约 3-4 厘米。一条线接种金葡菌（或
马红球菌），另一条线作为空白或不接种。
待划线的指示菌干后，用接种环挑取待测菌的纯菌落，在两条指示菌划线之间，以垂直划线的方式进行接种。划线的两端不要与指示菌划线接触。
划线力度：划线要均匀、清晰，力度适中，确保细菌能在平板上良好生长。
4、培养条件
温度：通常推荐在 **30℃** 下培养 24-48 小时。较低的温度（30℃）可以优化 CAMP 因子的产生和协同溶血效应，使增强区更加明显。
时间：24-48 小时。
气体环境：需氧条件。
5、结果观察与判读
观察时机：培养结束后，立即在明亮处观察平板。
判读标准：
单增李斯特菌：在靠近金葡菌划线的一侧，与金葡菌划线形成一个清晰的、呈箭头状或扇形的溶血增强区。这个增强区通常在两菌之间距离金葡菌划线约 2 毫米处开始出现。
伊氏李斯特菌：在靠近马红球菌划线的一侧，与马红球菌划线形成一个更宽的、呈箭头状或扇形的溶血增强区。
斯氏李斯特菌：可能在靠近金葡菌划线的一侧出现较弱的溶血增强区。
对照设置：每次实验都应设置阳性对照（如已知的单增李斯特菌标准株）和阴性对照（如已知的英诺克李斯特菌标准株）。
6、其他注意事项
划线间距：待测菌与指示菌划线之间的距离应控制在 1-2 厘米，过近或过远都会影响协同效应的观察。
避免接触：待测菌的划线两端绝对不能与指示菌的划线接触，否则会导致两菌直接接触，可能产生非特异性的溶血或抑制。
结果记录：详细记录溶血增强区的位置、形态、大小等特征。
三、通用注意事项与质量控制
1、生物安全：
单增李斯特菌是食源性致病菌，具有潜在的致病性，尤其是对孕妇、新生儿、老年人和免疫功能低下人群。
所有实验操作必须在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。
操作人员必须穿戴个人防护装备（PPE），包括手套、口罩、实验服等。
实验器材和废弃物必须按照生物安全规定进行处理和灭菌。
2、质量控制（QC）：
对照菌株：每次实验都必须使用已知的标准菌株作为阳性和阴性对照，以验证实验系统的准确性和可靠性。
培养基质量验证：定期对新批次的培养基进行质量验证，确保其无菌、成分合格、性能稳定。
菌株保藏：标准菌株应定期传代和保藏，以确保其纯度和活性。
记录与追溯：详细记录所有实验的操作步骤、条件、结果和观察到的现象，以便于结果的分析和追溯。
3、人员培训：
操作人员必须接受过专业的微生物学实验技术培训，熟悉相关的标准操作规程（SOP）。
4、结果报告：
溶血试验和 CAMP 试验的结果必须结合其他生化试验（如触酶试验、氧化酶试验、VP 试验等）和血清学试验等进行综合分析，才能得出最终的鉴定结论。
报告结果时应注明实验条件、使用的菌株和培养基等信息。
遵循以上注意事项，可以最大限度地减少实验误差，提高
单增李斯特菌鉴定的准确性和可靠性。
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