细胞传代操作指南：实验前准备、操作步骤及注意事项！
小杨 / 2025-12-23 10:55:04
一、耗材及试剂
需准备：
无菌器具：干净灭菌的培养皿、50mL 离心管、15mL 离心管、1mL 枪头、1mL 移液器、镊子、马克笔
试剂：细胞适配的培养液、血清、胰酶、双抗（青霉素 + 链霉素）、无菌 1×PBS
二、注意事项
1、所有进入超净台的物品、器具（包括手部），都需喷洒 75% 酒精消毒；
2、超净台内操作时，手部不可从敞开的培养皿、管口、瓶口、枪头盒上方经过（避免手臂带菌污染）；
3、拧开的管盖、瓶盖、培养皿盖，需正扣在台面，严禁倒扣。
三、操作原理
1、细胞贴壁原因：贴壁细胞会分泌细胞外基质（蛋白、多糖等成分），黏附在特殊处理的培养皿/瓶底部；未贴壁时细胞呈球形，贴壁后会伸展为上皮样或成纤维细胞样形态。
2、胰酶的解离作用：胰蛋白酶是丝氨酸水解酶，可切断多肽链中赖氨酸、精氨酸残基的羧基侧肽键，水解细胞间蛋白质，使贴壁细胞从器皿底部脱落分离。
3、消化后细胞变球形的原因：细胞自身骨架张力 + 培养液表面张力共同作用，使消化后的细胞恢复球形，镜下观察呈圆形。
4、胰酶的最佳条件：37℃、pH=8 时活性最强，因此消化需放入孵箱；通常用 0.25% 胰蛋白酶 + 0.02% EDTA（钙离子螯合剂）增强消化效果。
5、血清终止消化的原理：血清含有的蛋白可与胰酶结合，竞争性抑制胰酶活性，从而终止消化。
四、实验前准备
进入细胞房要求
穿专用实验服、拖鞋，戴好手套、口罩，保证进入超净台时无皮肤裸露。
观察细胞状态
孵箱取细胞前，手部喷 75% 酒精消毒；取出细胞后立即关闭孵箱（避免孵箱温湿度、CO₂浓度波动）；
显微镜下观察细胞，密度长至 90% 左右即可传代；观察后将细胞放回孵箱，避免长时间暴露。
前期准备工作（提前 20min 开始）
1、枪头盒喷 75% 酒精后放入超净台，打开盒盖（手勿经过盒上方），开启紫外照射超净台 + 枪头；
2、将培养液、血清、胰酶从 4℃冰箱取出，放入 37℃水浴锅预热；
3、20min 后关闭紫外，合上枪头盒，将实验用品放入超净台：
用镊子撕去瓶口封口膜（丢弃）；
用 75% 酒精浸泡的棉花擦拭移液器、枪头盒、离心管盖边缘、培养液瓶盖边缘及台面；
4、配置含血清的培养液（50mL 离心管中）：
管盖正扣台面，加入 45mL 含双抗的培养液（双抗：培养液 = 1:100）；
加入 5mL 血清（常规比例 10%，脆弱细胞可加至 20%）；
5、准备 15mL 离心管：
管盖、管壁标注细胞信息；
加入 4mL 含血清的培养液（用于终止消化），拧紧盖备用。
五、细胞传代操作步骤
1、孵箱取细胞：手部喷酒精后开孵箱，取细胞后立即关孵箱，将细胞放入超净台，再次对手部消毒后伸入超净台；
2、弃旧液 + PBS 润洗：
培养皿盖正扣台面，弃去原有培养液；
沿培养皿侧壁缓慢加入 1mL 1×PBS（勿直接吹细胞，避免物理损伤），盖上皿盖后轻轻上下晃动 10 次左右；
弃去 PBS；
3、加胰酶消化：
沿侧壁加胰酶（10cm 皿加 3mL，5cm 皿加 1.5mL），盖好皿盖后放入孵箱；
4、观察消化状态：
每隔 1min 镜下观察，轻轻晃动培养皿，若大片细胞移动即消化完成；禁止过度消化（避免细胞状态变差，勿消化至出现白色絮状物）；
5、终止消化 + 离心：
将培养皿放回超净台，轻轻吹打使细胞全部脱落；
将含细胞的胰酶液转移至提前备好的 15mL 离心管（含血清培养液），终止消化；
200rcf 离心 4min；
6、准备新培养皿：
取新培养皿，在皿盖上标注细胞信息（名称、代数、培养人、传代日期、传代比例）；
7、传代比例选择：
根据细胞生长速度决定（例：1 传 4 的细胞，取 1/4 消化后的细胞接种，3 天可长至 90% 密度）；
8、加培养液至新皿：
10cm 新皿中加入 9mL 含 10% 血清的培养液（后续加 1mL 细胞悬液，补足至 10mL 培养体系）；
9、重悬细胞：
离心后弃上清，加入 4mL 含 10% 血清的培养液，轻轻重悬细胞至单个细胞状态（可镜下确认分散度）；
10、接种 + 孵育：
按传代比例取对应体积的细胞悬液，加入新培养皿；
划“十”字或“米”字 7-10 次混匀细胞，将培养皿放入孵箱培养。
常用器皿的试剂用量参考
北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得最优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！