高盐察氏琼脂培养基的核心原理与使用方法及注意事项！
小杨 / 2025-12-23 09:44:03
高盐察氏琼脂培养基（High-Salt Czapek Dox Agar）是一种选择性培养基，主要用于从含菌量高的样品中分离和纯化耐高渗透压的真菌，尤其对常见污染菌——
曲霉菌（Aspergillus）和
青霉菌（Penicillium）有良好的选择性，同时能抑制大部分细菌和不耐盐真菌的生长。
一、培养基核心原理
高盐察氏琼脂的选择性和营养供给功能，基于以下 3 个关键设计：
1、高盐浓度：实现选择性抑制
培养基中添加7.5%-10% 的氯化钠（NaCl），创造高渗透压环境：
抑制作用：大部分细菌（如
大肠杆菌、
葡萄球菌）和普通真菌（如
酵母菌）的细胞膜渗透压调节能力较弱，高盐会导致细胞脱水、蛋白质变性，最终无法生长；
选择作用：
曲霉菌、
青霉菌等耐高渗透压真菌，能通过合成“相容性溶质”（如脯氨酸、甘油）调节细胞内渗透压，适应高盐环境，因此可正常萌发和繁殖。
2、察氏基础营养：满足目标真菌生长
察氏（Czapek Dox）是经典的真菌基础培养基配方，提供真菌生长所需的碳、氮、矿物质：
成分 作用
蔗糖 碳源：真菌代谢的主要能量来源，支持菌丝生长和孢子形成
硝酸钠（NaNO₃） 氮源：提供合成蛋白质、核酸的原料，促进真菌细胞增殖
磷酸二氢钾（KH₂PO₄） 磷源 + 缓冲剂：维持培养基 pH 稳定（通常 pH 5.5-6.0，适合真菌生长）
硫酸镁（MgSO₄・7H₂O） 镁离子：作为酶的辅酶，参与碳水化合物代谢
氯化钾（KCl） 钾离子：维持细胞渗透压和酶活性
硫酸亚铁（FeSO₄・7H₂O） 铁离子：参与细胞色素合成，辅助能量代谢
3、琼脂：凝固剂
添加 1.5%-2% 的琼脂，使培养基在常温下呈固体状态，便于真菌形成孤立的菌落（单个菌落来自单个孢子或菌丝片段），实现分离纯化。
二、培养基配方（经典配方，可按需调整）
以制备 1000mL 培养基为例，基础成分及用量如下：
成分 用量 备注
氯化钠（NaCl） 75-100g 高盐核心，按目标菌耐盐性调整
蔗糖 30g 可替换为等质量葡萄糖，碳源供给更快速
硝酸钠（NaNO₃） 2g 不可用氯化铵等替代（部分真菌不利用铵态氮）
磷酸二氢钾（KH₂PO₄） 1g 调节 pH 至 5.5-6.0，无需额外加酸碱
硫酸镁（MgSO₄・7H₂O） 0.5g 需用结晶水形式，避免浓度误差
氯化钾（KCl） 0.5g 微量矿物质，不可省略
硫酸亚铁（FeSO₄・7H₂O） 0.01g 易氧化，建议配成母液后灭菌前加入
琼脂 15-20g 按凝固硬度调整，夏季可适当增加
蒸馏水 1000mL 避免用自来水（含氯、杂质影响真菌生长）
三、使用方法（含制备、灭菌、接种、培养全流程）
1、培养基制备（无菌操作前步骤）
溶解成分：先在烧杯中加入 800mL 蒸馏水，依次加入氯化钠、蔗糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾，搅拌至完全溶解（高盐可能需小火加热助溶，但避免煮沸）；
添加微量元素：将硫酸亚铁用 10mL 蒸馏水配成母液，过滤后加入上述溶液中（避免 Fe²+ 氧化成 Fe³+ 产生沉淀）；
定容与调 pH：补加蒸馏水至 1000mL，用 pH 计检测 pH，若偏离 5.5-6.0，用 1mol/L HCl 或 NaOH 微调；
加琼脂并融化：加入琼脂，小火加热并不断搅拌（防止糊底），直至琼脂完全融化（溶液澄清透明）；
分装：将融化的培养基分装至锥形瓶（每瓶不超过容积的 1/2，便于灭菌后摇匀），加棉塞或硅胶塞，外包牛皮纸。
2、灭菌（关键步骤，防止杂菌污染）
灭菌方式：采用高压蒸汽灭菌，条件为 121℃、103.4kPa（1.05kg/cm²），维持 20 分钟；
灭菌后处理：灭菌结束后，待压力降至 0 时取出锥形瓶，轻轻摇匀（避免气泡），放置于 50-60℃水浴中保温（防止琼脂凝固，便于倒平板）。
3、倒平板（无菌操作开始）
无菌环境：在超净工作台或生物安全柜内进行，先紫外线灭菌 30 分钟，再开风机通风 10 分钟；
倒板操作：手持锥形瓶，拔去棉塞，瓶口过火焰灭菌（1-2 秒），向无菌培养皿（直径 90mm）中倒入约 20mL 培养基，每个培养皿倒满 1/3-1/2 即可；
凝固：盖上皿盖，水平放置于超净台内，待培养基自然冷却凝固（约 30 分钟，避免移动导致表面不平整），标记培养基名称、制备日期。
4、样品接种（分离目标真菌）
根据样品类型选择接种方法，核心是让样品均匀分布在培养基表面，形成孤立菌落：
固体样品（如食品、土壤）：
取 10g 样品，加入 90mL 无菌生理盐水，振荡 10 分钟制成 1:10 稀释液；
按 10 倍梯度稀释（1:100、1:1000…），选择 3 个适宜稀释度（如 1:100-1:10000）；
每个稀释度取 0.1mL 稀释液，滴加在培养基表面，用无菌涂布棒将液体均匀涂满整个平板（涂布棒需先过火焰灭菌，冷却后使用）。
液体样品：直接取 0.1-0.2mL 样品，涂布于培养基表面即可。
纯培养转接：若需纯化已分离的真菌，用无菌接种针挑取单个菌落，在新的高盐察氏琼脂平板上划线（如三区划线法），避免菌落重叠。
5、培养与观察
培养条件：置于25-28℃恒温培养箱中，避光培养（部分真菌对光敏感，影响孢子形成）；
培养时间：根据真菌生长速度调整，一般为 5-7 天（
曲霉菌、
青霉菌通常 3-5 天可见菌落，慢生菌需延长至 10 天）；
菌落识别：
曲霉菌：菌落较大，呈绒毛状或棉絮状，表面有颜色（如黄曲霉素为黄色、黑曲霉为黑色），背面有色素扩散；
青霉菌：菌落较小，呈绒状，多为青绿色，背面无色或淡黄色；
杂菌：若出现黏液状（细菌）、乳白色光滑菌落（
酵母菌），说明灭菌不彻底或操作污染，需重新实验。
6、后续处理
纯化：挑取目标真菌的单个菌落，转接至新鲜的高盐察氏琼脂斜面，25℃培养 5 天，制成斜面菌种，4℃冰箱保存（可保存 1-3 个月）；
鉴定：通过显微镜观察菌丝、孢子形态（如
曲霉菌有顶囊、
青霉菌有扫帚状分生孢子梗），结合分子生物学方法确认菌种。
四、注意事项
高盐溶解问题：氯化钠溶解度较高，但大量添加时需充分搅拌，避免灭菌后出现盐结晶（影响真菌生长）；
灭菌时间控制：灭菌时间过长会导致蔗糖碳化（培养基变黑），影响碳源供给，需严格控制 20 分钟；
无菌操作：倒平板、接种时必须在无菌环境中进行，避免空气中的杂菌污染，导致分离失败；
样品稀释度：若样品含菌量高，需提高稀释度，避免菌落密集重叠；若含菌量低，可直接涂样或增加取样量；
pH 控制：真菌对 pH 敏感，pH 过高（>6.5）会促进细菌生长，pH 过低（<5.0）会抑制部分曲霉菌，需严格调至 5.5-6.0。
通过以上原理和方法，高盐察氏琼脂可高效分离环境中的耐高渗真菌，是食品卫生检测、环境微生物学研究的常用培养基。
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