微生物实验室质控标准菌株的制备方法与操作流程及要点！
小杨 / 2025-12-20 10:46:05
百欧博伟生物：微生物实验室的质控标准菌株是用于方法验证、培养基适用性检查、仪器校准、人员操作考核的核心材料，其制备需遵循标准化、可溯源、无污染的原则，全程严格控制污染风险，保证菌株活性与稳定性。以下是完整的制备流程、关键操作要点及质量控制要求。
一、核心原则与菌株来源
菌株溯源性质控菌株需来自权威机构，如中国微生物菌种保藏管理委员会（CGMCC）、美国典型培养物保藏中心（ATCC）、欧洲菌种保藏中心（DSMZ）等，需具备明确的菌株编号、种属名称、特性描述及传代次数记录。严禁使用临床分离的未鉴定菌株或来源不明菌株作为质控菌株。
传代控制标准菌株的传代次数不宜超过 5 代（从原始冻干菌株复苏后为第 1 代），避免因多次传代导致菌株的生理生化特性、耐药性等发生变异。
二、制备流程（以细菌为例）
（一）菌株复苏
材料准备
试剂：无菌生理盐水、适配的液体培养基（如营养肉汤 NB、胰酪大豆胨肉汤 TSB）、固体培养基（如营养琼脂 NA、胰酪大豆胨琼脂 TSA）。
耗材：无菌离心管、移液管、接种环、酒精灯、无菌培养皿。
仪器：超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器。
操作步骤
超净工作台内，用无菌接种环或移液枪吸取适量无菌生理盐水，注入冻干菌株的安瓿瓶中，轻轻振荡使冻干粉末完全溶解。
吸取菌悬液，接种至液体培养基中，置于菌株最适温度下振荡培养（如细菌 35±2℃，培养 16-24h；真菌 25±2℃，培养 48-72h）。
取培养后的菌液，划线接种至固体培养基平板，进行纯化培养，获得单菌落。
挑取形态典型的单菌落，再次划线纯化，确保菌株无杂菌污染。
（二）菌株鉴定与特性验证
复苏后的菌株需进行确认鉴定，保证其与标准菌株的特性一致，避免复苏错误或污染。
形态学鉴定：观察菌落形态（大小、颜色、边缘、隆起度）、革兰染色或芽孢染色后的镜下形态。
生化鉴定：针对目标菌株，选择特异性生化试验（如肠杆菌科的 IMViC 试验、葡萄球菌的血浆凝固酶试验）。
特异性验证：若为致病菌（如
沙门氏菌、
金黄色葡萄球菌），需通过血清学试验（如玻片凝集试验）或分子生物学方法进一步确认。
（三）菌悬液制备与浓度标定
菌悬液制备
挑取纯化后的单菌落，接种至液体培养基中，最适条件下培养至对数生长期（此时菌株活性最强，稳定性最好）。
取培养后的菌液，4000r/min 离心 10min，弃上清液，用无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）重悬菌体，洗涤 2-3 次，去除培养基残留。
用无菌生理盐水/ PBS 调整菌悬液浓度，制成工作菌悬液（用于日常质控）或储备菌悬液（用于长期保藏）。
浓度标定（平板计数法）
对菌悬液进行10 倍系列稀释（如 10⁻¹、10⁻²……10⁻⁸），选择 3 个适宜稀释度。
取每个稀释度的菌液 0.1mL，涂布于固体培养基平板，每个稀释度做 3 个平行。
培养后计数单菌落数，计算菌悬液的浓度（CFU/mL）：
浓度= 涂布体积 平均菌落数×稀释倍数
（四）分装与保藏
根据使用需求，将标定后的菌悬液分为工作用菌株和保藏用菌株两类，分别处理。
类型 保藏方法 操作要点 保存期限
工作用菌株 斜面保藏法 将菌悬液接种至固体培养基斜面，培养后密封试管，4℃冷藏 1-3 个月
保藏用菌株 甘油冻存法 菌悬液与 50% 无菌甘油按 1:1 体积混合，终甘油浓度 20%-30%，分装至冻存管，-70℃ 或液氮保存 1-3 年
保藏用菌株 冻干保藏法 （适用于长期保藏）将菌悬液与保护剂混合，冻干后密封安瓿瓶，4℃保存 5-10 年
三、全程质量控制要点
1、无菌控制
所有耗材、培养基需经高压蒸汽灭菌（121℃，15-20min）或过滤除菌；超净工作台使用前需紫外照射 30min 消毒。
操作全程严格遵循无菌操作规范，避免杂菌污染；每批次制备需设置空白对照（未接种的培养基同步培养，观察是否有菌落生长）。
2、稳定性监测
保藏的菌株需定期复苏验证：斜面保藏菌株每月复苏 1 次，甘油冻存菌株每 6 个月复苏 1 次，检查菌株的形态、生化特性是否稳定。
若发现菌株特性变异，立即停止使用，重新从原始标准菌株复苏。
标识管理所有菌株管/斜面需清晰标注菌株名称、编号、传代次数、制备日期、保存条件、有效期，避免混淆。
3、安全管理
废弃菌液、培养基需经高压灭菌后处理，防止生物危害。
四、常见问题及解决方案
常见问题 原因分析 解决方案
冻干菌株复苏失败 安瓿瓶开启时污染；菌株冻存时间过长；培养基不适配 严格无菌操作；选择保质期内的菌株；更换适配的培养基
菌悬液浓度偏低 菌株培养未达对数期；离心洗涤时菌体损失过多 优化培养条件至对数生长期；降低离心转速或缩短离心时间
菌株特性变异 传代次数过多；保存温度不当 控制传代次数≤5 代；严格按照推荐温度保藏
杂菌污染 操作过程无菌控制不足；培养基灭菌不彻底 加强无菌操作；培养基灭菌后进行无菌性检查
五、应用场景
制备好的质控标准菌株主要用于：
培养基适用性检查：验证培养基的促生长能力、选择性和指示特性。
方法验证：如食品微生物检验中，验证致病菌分离检测方法的灵敏度和特异性。
仪器校准：如菌落计数器、自动微生物鉴定系统的性能校准。
人员考核：评估实验人员的接种、分离、鉴定操作能力。
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