小鼠原代结肠成纤维细胞培养方法的准备工作及操作步骤！
小杨 / 2025-12-19 09:20:42
一、实验准备
1、试剂与耗材
培养基：DMEM/F12 培养基（含 L - 谷氨酰胺），添加 10% 胎牛血清（FBS，需热灭活）、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素；也可选用原代成纤维细胞专用培养基提升细胞存活率。
消化液：0.1% 胶原酶 I + 0.05% 胰酶 - EDTA 混合液（用无血清 DMEM/F12 配制，过滤除菌）；PBS 缓冲液（不含钙镁离子）。
耗材：无菌手术器械（眼科剪、眼科镊、止血钳）、60 mm 细胞培养皿、100 目细胞筛网、离心管、移液管、无菌纱布。
其他：75% 酒精、含双抗的 PBS、细胞冻存液（90% FBS + 10% DMSO）。
2、实验环境
超净工作台紫外灭菌 30 min；培养箱预热至 37℃、5% CO₂、饱和湿度。
二、操作步骤
1、小鼠结肠组织取材（无菌操作）
选取 6-8 周龄 SPF 级小鼠，脱颈处死，75% 酒精浸泡全身消毒 3-5 min，转移至超净台。
无菌打开腹腔，用止血钳夹取结肠组织（从盲肠末端至直肠段），放入含双抗的 PBS 平皿中，反复漂洗 3 次，去除表面血液与脂肪组织。
用眼科剪纵向剪开结肠，用 PBS 冲洗肠腔内容物；再用无菌纱布轻轻刮擦肠黏膜表面，去除大部分上皮细胞（减少后续杂细胞污染）。
2、组织剪碎与酶解消化
将预处理后的结肠组织剪切成 1-2 mm³ 的小块，转移至 15 mL 离心管，加入 5-8 mL 胶原酶 I - 胰酶混合消化液，37℃ 摇床振荡消化 60-90 min（每 15 min 轻轻颠倒混匀 1 次）。
消化终点判断：组织块边缘模糊、溶液变浑浊，即可终止消化；若消化过度会导致细胞活性下降。
加入等体积含血清的培养基，中和消化酶活性；用 100 目细胞筛网过滤，去除未消化的组织碎片，收集滤液。
3、细胞离心与接种
滤液 1000 r/min 离心 5 min，弃上清；用含 10% FBS 的完全培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀。
将细胞悬液接种至 60 mm 细胞培养皿，每皿加入 3 mL 完全培养基，轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布。
放入培养箱，静置培养 24 h，期间不挪动培养皿，利于细胞贴壁。
4、细胞纯化与换液
差速贴壁纯化：培养 24 h 后，吸弃旧培养基（未贴壁的上皮细胞、免疫细胞会随培养基被去除），用 PBS 轻轻漂洗 1 次，加入新鲜完全培养基继续培养。
后续每 2-3 d 换液 1 次，观察细胞生长状态：原代结肠成纤维细胞贴壁后呈梭形或星形，3-5 d 后可见细胞克隆，7-10 d 细胞汇合度可达 80%-90%。
5、传代培养
当细胞汇合度达 80%-90% 时进行传代，避免过度汇合导致细胞老化。
吸弃培养基，用 PBS 漂洗 2 次；加入 1 mL 0.25% 胰酶 - EDTA，覆盖细胞表面，37℃ 孵育 1-2 min。
显微镜下观察，当细胞回缩变圆、细胞间隙增大时，立即加入含血清培养基中和胰酶。
用移液管轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，1000 r/min 离心 5 min，弃上清。
完全培养基重悬细胞，按 1:2 或 1:3 的比例接种至新培养皿，补充培养基后放回培养箱培养。
注意：原代细胞传代次数建议不超过 5-8 代，超过代数后细胞易出现老化、形态改变及功能衰退。
6、冻存与复苏
冻存：取对数生长期的细胞，按传代方法消化收集，离心后用冻存液重悬，调整细胞密度至 1×10⁶ - 5×10⁶ 个 /mL；分装至冻存管，程序降温（4℃ 30 min→-20℃ 1 h→-80℃ 过夜）后转移至液氮长期保存。
复苏：从液氮中取出冻存管，迅速放入 37℃ 水浴锅快速摇晃解冻（1-2 min 内完成）；离心去除冻存液，完全培养基重悬细胞后接种，24 h 后换液去除死细胞。
三、关键注意事项
杂细胞控制：上皮细胞污染是主要问题，除了取材时刮擦黏膜，还可通过二次差速贴壁（首次贴壁 2 h 后，转移未贴壁细胞至新皿，成纤维细胞贴壁更快）或免疫磁珠分选进一步纯化。
消化条件优化：胶原酶与胰酶的比例、消化时间需根据组织状态调整，过短消化细胞产量低，过长消化细胞活性差。
培养环境稳定：血清质量对原代细胞生长至关重要，建议选用批次稳定的 FBS；避免频繁挪动培养皿，减少对细胞的机械损伤。
无菌控制：原代细胞抵抗力弱，全程严格无菌操作，培养基中可短期添加双抗（长期培养建议去除双抗，避免细胞毒性）。
四、细胞鉴定要点
培养后的细胞需验证纯度与身份，常用方法：
免疫荧光染色：波形蛋白、纤维连接蛋白，阳性率≥90%，上皮细胞标志物阴性。
形态学观察：细胞呈典型梭形，汇合后呈漩涡状排列，无上皮细胞的铺路石样形态。
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