鸭胚成纤维细胞永生化抗原转染实验的具体操作步骤！
小杨 / 2025-12-13 09:43:02
百欧博伟生物：目前
鸭胚成纤维细胞永生化多通过慢病毒介导 SV40 大 T 抗原转染实现，该方法转化效率高且细胞稳定性好，具体操作步骤围绕载体构建、病毒包装、细胞转染筛选等核心环节展开，详细流程如下：
前期准备：原代鸭胚成纤维细胞分离培养
选取 10 日龄左右健康鸭胚，在超净工作台内无菌取出鸭胚，去除头部、内脏等部位，仅保留躯干组织。
用无菌剪刀将躯干剪碎成 1 - 2cm³ 的组织块，加入少量含 5% 胎牛血清的 MEM 培养基，吹打分散组织块后，用 300 目细胞筛网过滤去除大块杂质。
将过滤后的细胞悬液转入培养瓶，置于 37℃、5% CO₂培养箱中培养。静置 6h 后弃去未贴壁的细胞及上清，补加新鲜培养基，待细胞长成单层后，用 0.25% 胰蛋白酶消化传代，持续培养至 5 - 10 代，获得状态稳定的原代鸭胚成纤维细胞备用。
核心环节一：构建 SV40 大 T 抗原慢病毒表达载体
PCR 扩增目的基因：以含 SV40 大 T 抗原 cDNA 序列的 sv40tsa58 质粒为模板，依据 SV40 完整基因组设计特异性引物。配置 50μl 高保真 PCR 反应体系，包含引物混合液 1.5μl、10×PfU DNA 聚合酶反应混合物 5μl、PfU DNA 聚合酶 0.5μl、模板 DNA 质粒 1μl，剩余用灭菌去离子水补齐。反应程序设定为 95℃预变性 2min；95℃15s、58℃30s、68℃4min，循环 36 次；最后 68℃延伸 5min，扩增得到 SV40 大 T 抗原全长 cDNA 并纯化产物。
载体重组构建：将纯化后的 PCR 产物通过 Topo 克隆接入 pENTR™TOPO 载体，得到 pENTR - SV40T 质粒。随后进行 LR 重组反应，在 1.5ml 离心管中加入 7μl pENTR - SV40T 质粒、1μl 目标慢病毒载体、8μl TE 缓冲液及 2μl LR Clonase™II 酶混合物，25℃孵育 1h 后，加 1μl 蛋白酶 k 溶液终止反应，37℃孵育 10min，最终构建出 SV40 大 T 抗原慢病毒表达载体。
核心环节二：慢病毒包装
选取 293FT 工程细胞作为包装细胞，提前接种到培养瓶中，待细胞汇合度达 70% - 80% 时进行转染。
采用脂质体 Lipofectamine™2000 介导，将构建好的 SV40 大 T 抗原慢病毒表达载体，与包装质粒 pCMV - VSV - G 和 pSPAX2 共同转染 293FT 细胞。
转染后置于 37℃、5% CO₂培养箱中培养 48 - 72h，收集细胞培养上清液，经离心、过滤去除细胞碎片，获得含 SV40 大 T 抗原的重组慢病毒液，可进一步浓缩处理以提高病毒滴度。
核心环节三：慢病毒转染原代鸭胚成纤维细胞
将前期培养好的原代鸭胚成纤维细胞接种到 6 孔板中，每孔细胞数约 2×10⁵个，培养至细胞汇合度达 50% - 60%。
去除孔内旧培养基，加入适量稀释后的重组慢病毒液，同时可添加少量聚凝胺以提高转染效率，置于培养箱中孵育 6 - 10h。
孵育结束后，弃去含病毒的培养液，更换为新鲜的含 5% 胎牛血清的 MEM 完全培养基，继续培养 24 - 48h。
筛选与纯化：获得稳定永生化细胞
当转染后的细胞汇合度接近 80% 时，按 1:5 比例传代培养。待细胞密度达 50% - 70%，向培养基中加入博来霉素或 G418 等筛选药物（浓度依据预实验确定，如 G418 可设 400μg/mL）。
持续培养并定期更换含筛选药物的新鲜培养基，去除未成功转染的细胞，约 1 - 2 周后可出现抗性细胞克隆。
采用滤纸法分离单个抗性克隆，将其接种到新的培养孔中扩大培养。后续可通过免疫荧光检测 SV40 大 T 抗原的表达，确认转染成功。
永生化验证与冻存
进行传代对比实验，观察细胞能否长期稳定传代，同时与未转染的原代细胞对比，验证其是否突破分裂限制；还可通过核型分析检测细胞染色体稳定性。
选取状态良好的永生化细胞进行冻存，弃去培养基后用 PBS 清洗 1 - 2 次，加入胰酶消化，随后用完全培养基终止消化。1000rpm 离心 5min，弃上清后用含 10% DMSO 的胎牛血清重悬细胞，分装到冻存管中，经程序降温盒放入 - 80℃冰箱过夜，次日转入液氮长期保存。
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