原代培养小鼠肾小管上皮细胞的具体步骤及关键注意事项！
小杨 / 2025-12-11 09:34:03
原代培养
小鼠肾小管上皮细胞（RTECs）的核心是无菌分离肾皮质组织→酶解获得肾小管片段/单细胞→纯化去除间质细胞→贴壁培养与扩增，操作需严格遵循无菌原则，且要精准控制酶解时间（避免细胞损伤）。以下是分阶段的详细操作步骤，附关键注意事项：
一、实验前准备（核心：无菌 + 试剂预冷）
1、实验材料与试剂配制
类别 具体内容
实验动物 6-8 周龄 SPF 级小鼠（C57BL/6 或 BALB/c，体重 20-25g，雌雄不限）
消化液 胶原酶 Ⅳ（1.5 mg/mL）+ 0.25% 胰酶 - EDTA，用无钙镁 PBS配制，0.22 μm 滤膜过滤除菌，4℃保存
完全培养基 DMEM/F12（1:1）+ 10% 胎牛血清（FBS，灭活）+ 1% 双抗（青霉素 100 U/mL + 链霉素 100 μg/mL）+ 生长因子（EGF 10 ng/mL + 胰岛素 5 μg/mL）
辅助试剂 无钙镁 PBS（预冷）、0.1% 明胶溶液（包被培养皿用）、台盼蓝染色液、200 目细胞筛
实验器材 眼科剪、眼科镊、无菌培养皿（60 mm/100 mm）、离心管（15 mL/50 mL）、移液管，均需高压灭菌
2、预处理操作
超净台紫外消毒 30 分钟，通风 10 分钟；
0.1% 明胶溶液铺在培养皿表面，37℃孵育 30 分钟，吸弃多余明胶，晾干备用（促进上皮细胞贴壁）；
消化液、完全培养基、预冷 PBS 提前放入 37℃水浴预热。
二、肾皮质组织分离（核心：去除髓质和血管，减少杂质）
小鼠处死后消毒：颈椎脱臼处死小鼠，75% 酒精浸泡全身 5 分钟，转移至超净台内的无菌培养皿中。
肾脏摘取：无菌操作打开腹腔，用眼科镊轻轻拉出双侧肾脏，放入盛有预冷无钙镁 PBS 的培养皿中，冲洗 3 次，去除表面血迹和脂肪组织。
肾皮质分离：
用眼科镊捏住肾脏一端，眼科剪小心剪开肾包膜，剥离并丢弃包膜；
用剪刀切除肾髓质（颜色较深的部分，肾小管主要集中在浅色的肾皮质），仅保留肾皮质组织；
将肾皮质剪成 1 mm³ 左右的细小组织块，用预冷 PBS 反复吹洗 3-4 次，静置后弃上清，去除红细胞和游离杂质。
三、酶解消化（核心：避免过度消化，防止细胞破裂）
向组织块中加入5 倍体积的预热消化液，转移至 15 mL 无菌离心管中。
37℃恒温摇床振荡消化 30-40 分钟，转速控制在 100 rpm；每 10 分钟轻轻颠倒离心管 1 次，显微镜下观察组织块分散情况（组织块变松散、溶液略浑浊即可）。
加入等体积的完全培养基终止消化，用移液管轻轻吹打 10-15 次，使组织块进一步分散为细胞悬液。
细胞悬液通过200 目细胞筛过滤，去除未消化的组织碎片，收集滤液至新的 15 mL 离心管中。
四、细胞纯化与接种（核心：差速贴壁去除成纤维细胞）
离心收集细胞：800 rpm、4℃离心 5 分钟，弃上清；用预冷 PBS 重悬细胞沉淀，再次 800 rpm 离心 5 分钟，洗去残留酶液。
细胞计数与活力检测：用完全培养基重悬细胞沉淀，取少量细胞悬液与台盼蓝染色液 1:1 混合，计数活细胞（活细胞率需≥90%）。
差速贴壁纯化：
按 1×10⁶ cells/cm² 的密度，将细胞悬液接种到预包被明胶的培养皿中；
37℃、5% CO₂培养箱中培养 2 小时，此时成纤维细胞会快速贴壁，而上皮细胞贴壁较慢；
轻轻吸弃培养基及未贴壁细胞，用预热 PBS 冲洗培养皿 1 次，加入新鲜完全培养基。
五、培养与传代（核心：控制融合度，维持上皮细胞表型）
1、原代培养
接种后 24 小时内不移动培养皿，让上皮细胞充分贴壁；
48 小时后首次更换完全培养基，去除未贴壁的死细胞；
之后每 2-3 天更换 1 次培养基，显微镜下观察细胞生长状态（原代 RTECs 呈多边形/鹅卵石样贴壁生长，铺路石状排列）。
2、传代操作（细胞融合度达 80-90% 时进行）
吸弃培养基，用预热无钙镁 PBS 冲洗细胞表面 2 次，去除残留血清；
加入适量 0.25% 胰酶 - EDTA，覆盖细胞表面，37℃孵育 2-3 分钟，显微镜下观察到细胞变圆、边缘收缩时，立即加入完全培养基终止消化；
用移液管轻轻吹打细胞表面，使细胞脱落形成悬液，800 rpm 离心 5 分钟，弃上清；
完全培养基重悬细胞沉淀，按 1:2 的比例接种到新的明胶包被培养皿中，继续培养。
注意：原代 RTECs传代不超过 5 代，超过 5 代后细胞易失去上皮极性，发生梭形化（间质样转化）。
六、关键质量控制与注意事项
纯度鉴定：培养至第 2 代时，通过免疫荧光检测上皮细胞标志物（CK18/CK19），阳性率需≥90%；间质细胞标志物（α-SMA）阴性，确保无成纤维细胞污染。
常见问题排查
贴壁率低：可能是酶解过度/不足，或培养皿未包被；优化酶解时间至 30-35 分钟，改用胶原 Ⅰ 型包被培养皿。
成纤维细胞污染：差速贴壁时间不足；延长首次贴壁时间至 2.5-3 小时，或加入成纤维细胞抑制剂。
细胞生长缓慢：培养基生长因子不足；补充 ITS（胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒）混合添加剂。
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