产气荚膜梭状芽孢杆菌菌落计数法的标准操作规程及注意事项！
小杨 / 2025-11-26 09:24:36
产气荚膜梭状芽孢杆菌（Clostridium perfringens，简称产气荚膜梭菌）是革兰氏阳性、厌氧、产芽孢的致病菌，广泛存在于土壤、污水、食品及人和动物肠道中，可引发气性坏疽、食物中毒等疾病。其菌落计数需结合厌氧菌培养特性和选择性培养基，核心方法为平板倾注法，辅以菌落形态鉴定和生化确认，确保计数准确性。以下是详细的标准操作规程（SOP）、原理、注意事项及质量控制要点：
一、核心原理
产气荚膜梭菌为严格厌氧菌，在有氧环境下无法生长；能产生耐热芽孢，可耐受一定温度（如 80℃ 10 分钟）；发酵葡萄糖、乳糖等产酸产气，在含指示剂的培养基上形成特征菌落（如黑色菌落、周围有溶血环）。
菌落计数的核心逻辑：
样品前处理：通过加热（80℃ 10 分钟）杀灭非芽孢菌和脆弱芽孢，保留产气荚膜梭菌的耐热芽孢，减少杂菌干扰；
梯度稀释：将样品稀释至合适浓度，确保平板上形成 30~300 个可计数的菌落；
厌氧培养：采用厌氧罐、厌氧袋或厌氧工作站，提供严格无氧环境（O₂浓度＜1%）；
选择性分离：使用含抗生素和指示剂的培养基，抑制革兰氏阴性菌和其他厌氧菌，目标菌因产生硫化氢（H₂S）与铁离子结合形成黑色菌落，便于识别；
菌落计数与确认：统计特征菌落数，结合生化试验排除假阳性，最终计算样品中产气荚膜梭菌的菌落形成单位（CFU/g 或 CFU/mL）。
二、标准操作规程（SOP）
（一）实验材料准备
培养基：
首选：亚硫酸盐 - 多粘菌素 - 磺胺嘧啶琼脂（SPS 琼脂） —— 选择性强，含亚硫酸盐、柠檬酸铁铵（指示剂）和多粘菌素/磺胺嘧啶（抑制革兰氏阴性菌），产气荚膜梭菌形成黑色菌落，周围有晕环；
替代：强化梭菌琼脂（RCA）+ 卡那霉素（200 μg/mL） —— 适用于食品、环境样品，抑制杂菌效果好；
增菌培养基（可选）：疱肉培养基（Cooked Meat Medium, CMM） —— 用于样品中目标菌浓度极低时的预增菌。
试剂与耗材：
稀释液：0.1% 蛋白胨水（或生理盐水），需煮沸除氧后冷却（避免厌氧环境被破坏）；
厌氧设备：厌氧罐、厌氧产气袋（含催化剂，如钯）、厌氧指示剂（亚甲基蓝，无氧时无色，有氧时蓝色）；
其他：无菌离心管、移液枪、培养皿（90 mm）、恒温水浴锅（80℃）、恒温培养箱（37℃）。
样品：食品、土壤、污水、粪便等，需无菌采样并尽快检测（≤24 小时，4℃冷藏运输）。
（二）操作步骤
1、样品前处理（关键步骤：芽孢活化与杂菌抑制）
称取 10 g（或吸取 10 mL）样品，加入 90 mL 预冷的无菌稀释液（0.1% 蛋白胨水），涡旋振荡 2 分钟，制成 1:10 匀浆液；
将匀浆液放入 80℃ 恒温水浴锅，保温 10 分钟（精确计时），迅速取出并冰水浴冷却至室温（目的：杀灭非芽孢菌和不耐热芽孢，仅保留产气荚膜梭菌的耐热芽孢）；
若样品中目标菌浓度极低（如洁净环境样品），可先将匀浆液接种至疱肉培养基，37℃ 厌氧培养 18~24 小时（预增菌），再进行后续稀释。
2、梯度稀释
取冷却后的 1:10 匀浆液 1 mL，加入 9 mL 无菌稀释液（除氧后），涡旋混匀，制成 1:100 稀释液；
按上述方法依次梯度稀释至 10⁻⁶~10⁻⁸（根据样品污染程度调整，食品样品通常稀释至 10⁻⁴~10⁻⁶，土壤样品需稀释至 10⁻⁶~10⁻⁸）；
稀释过程中，每步移液枪头需无菌更换，稀释液试管需加盖密封，避免氧气进入。
3、平板倾注与厌氧培养
取 3 个连续稀释度的稀释液，每个稀释度吸取 1 mL 加入无菌培养皿（平行做 3 个重复）；
倾注融化并冷却至 45~50℃的 SPS 琼脂（避免温度过高杀死芽孢，过低导致培养基凝固），迅速轻轻旋转培养皿，使稀释液与培养基充分混匀，静置凝固（约 15 分钟）；
将凝固后的平板倒置放入厌氧罐，放入厌氧产气袋和亚甲基蓝指示剂，密封厌氧罐（确保无漏气），置于 37℃ 恒温培养箱中培养 24~48 小时（培养时间不足会导致菌落过小，超过 48 小时可能出现杂菌污染）。
4、菌落计数与形态鉴定
取出厌氧罐，观察指示剂（亚甲基蓝无色，说明厌氧环境合格）；
统计每个平板上的特征菌落：SPS 琼脂上为黑色、圆形、光滑、直径 2~4 mm，周围有淡棕色晕环（H₂S 与铁离子反应产物），菌落中心黑色更深；
排除异常菌落：白色、透明、无晕环的菌落为杂菌，不予计数；
选择菌落数在 30~300 之间的平板进行计数，若所有平板菌落数均超过 300，取最高稀释度的平板计数；若均低于 30，取最低稀释度的平板计数（结果表示为“＜XX CFU / 样品”）。
5、生化确认（排除假阳性，可选但推荐）
挑取 3~5 个特征菌落，接种至疱肉培养基（37℃ 厌氧培养 18 小时），进行以下鉴定：
Nagler 反应：接种菌落至含 20% 卵黄的琼脂平板，一侧涂抹 α- 毒素抗血清，37℃ 厌氧培养 24 小时；若未涂抹抗血清的一侧出现乳白色沉淀环（α- 毒素分解卵黄卵磷脂），涂抹侧无沉淀环，为阳性（产气荚膜梭菌特有）；
产酸产气试验：接种至葡萄糖、乳糖、蔗糖发酵管，37℃ 厌氧培养 24 小时，产气荚膜梭菌发酵所有糖类，产酸产气（培养基变黄，倒置小管内有气体）；
革兰氏染色：革兰氏阳性粗短杆菌，无鞭毛，形成椭圆形芽孢（位于菌体中央或近端，不膨出菌体）。
6、结果计算
公式：样品中产气荚膜梭菌浓度（CFU/g 或 CFU/mL）= 平均菌落数 × 稀释倍数 ÷ 接种体积（1 mL）；
示例：10⁻⁵ 稀释度的 3 个平板菌落数分别为 45、52、48，平均菌落数 =（45+52+48）/3=48.3，稀释倍数 = 10⁵，接种体积 = 1 mL，则样品浓度 = 48.3 × 10⁵ = 4.83 × 10⁶ CFU/g（结果保留 2 位有效数字，可表示为 4.8×10⁶ CFU/g）。
三、关键注意事项
1、厌氧环境控制：
培养基需煮沸除氧（100℃ 15 分钟），冷却后尽快使用，避免氧气重新溶解；
厌氧罐密封前需排出内部空气（可通过反复抽真空 - 充氮气 3 次实现），产气袋需在有效期内使用，催化剂（钯）需保持活性（若亚甲基蓝指示剂始终蓝色，说明厌氧失败，需更换产气袋或催化剂）；
平板培养时需倒置，避免冷凝水滴落导致菌落融合。
2、样品前处理精度：
加热温度和时间必须严格控制（80℃ 10 分钟），温度过高会杀死产气荚膜梭菌芽孢，过低则无法抑制杂菌；
匀浆液需充分振荡（≥2 分钟），确保样品均匀分散，避免菌落聚集导致计数偏低。
3、培养基选择与质量：
需使用新鲜制备的 SPS 琼脂（存放不超过 7 天），抗生素需在培养基冷却至 45~50℃时加入（避免高温破坏药效）；
若培养基颜色异常或有杂菌污染，需重新制备。
4、稀释与接种操作：
稀释液需无菌、除氧，每步稀释后需涡旋混匀（≥1 分钟），避免稀释不均；
接种时移液枪头需深入稀释液液面下吸取，减少氧气带入。
5、菌落识别准确性：
部分梭菌（如
破伤风梭菌、
肉毒梭菌）也可能在 SPS 琼脂上形成黑色菌落，需通过 Nagler 反应、产糖试验等生化方法确认，避免假阳性计数；
若菌落过于密集或融合，需重新稀释接种。
四、质量控制（QC）要点
1、阳性对照：
每次实验需设置阳性对照：接种产气荚膜梭菌标准菌株（如
ATCC 13124），按相同步骤处理，应在 SPS 琼脂上形成典型黑色菌落，Nagler 反应阳性；
标准菌株需定期传代（每 3~6 个月），4℃ 疱肉培养基中保存，避免失活。
2、阴性对照：
空白对照：取 1 mL 无菌稀释液接种平板，培养后应无菌落生长（排除培养基、耗材污染）；
3、计数精密度：
同一稀释度的 3 个平行平板菌落数变异系数（CV）应≤15%，否则需重新实验；
若不同稀释度平板的菌落数均在 30~300 之间，需计算各稀释度的平均值，确保结果一致性。
4、培养基质量控制：
每批次培养基需检测无菌性（37℃ 厌氧培养 24 小时，无杂菌生长）；
检测指示剂有效性：接种阳性菌株后，应形成明显黑色菌落（确保亚硫酸盐、柠檬酸铁铵有效）。
五、常见问题与解决方案
常见问题 可能原因 解决方案
平板无菌落生长 1.厌氧环境失败（指示剂蓝色）；2.加热处理过度（杀死芽孢）；3.样品中无目标菌；4.培养基抗生素浓度过高 1.更换产气袋和催化剂，重新密封厌氧罐；2.严格控制 80℃ 10 分钟，避免超时；3.增加预增菌步骤；4.调整抗生素浓度
杂菌过多（白色菌落占比高） 1.样品前处理不充分（杂菌芽孢未被抑制）；2.培养基选择性不足；3.稀释倍数过低 1.延长加热时间或增加稀释倍数；2.更换新鲜 SPS 琼脂，确保抗生素有效；3.提高稀释倍数
菌落颜色不典型（淡黑色） 1.培养时间不足（＜24 小时）；2.培养基指示剂含量不足；3.目标菌代谢活性低 1.延长培养至 48 小时；2.检查培养基配方，确保亚硫酸盐和柠檬酸铁铵添加量准确；3.优化培养温度（37±1℃），避免温度波动
计数结果偏高 1.菌落融合（稀释倍数不足）；2.假阳性菌落未排除 1.提高稀释倍数，确保菌落分散；2.对特征菌落进行生化确认，排除杂菌
计数结果偏低 1.稀释时样品未混匀；2.冷凝水滴落导致菌落融合；3.接种量不足 1.稀释后涡旋混匀≥1 分钟；2.平板倒置培养，避免冷凝水；3.确保接种量准确（1 mL），移液枪校准
六、应用场景
食品卫生检测：肉类、罐头、乳制品等食品中产气荚膜梭菌计数，判断是否符合食品安全标准；
环境监测：土壤、污水、医疗环境的污染程度评估，预防交叉感染；
临床诊断：粪便、伤口分泌物中目标菌计数，辅助诊断气性坏疽、食物中毒；
科研应用：耐药菌株筛选、消毒效果评价、益生菌对产气荚膜梭菌的抑制作用研究。
七、总结
产气荚膜梭菌的菌落计数核心是“芽孢活化 - 厌氧选择性培养 - 特征菌落鉴定”，关键在于严格控制厌氧环境、样品前处理精度和培养基质量，通过阳性/阴性对照和生化确认确保结果准确。实验中需重点关注厌氧有效性和杂菌抑制，避免因操作不当导致计数偏差。该方法适用于多类样品，是微生物检测中常用的标准化技术，为食品安全、临床诊断和科研提供可靠数据支持。
北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在
微生物菌种查询网中获得最优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！
下载附件
上一篇：ITC 肉汤培养基的使用方法与操作流程及注意事项！
下一篇：刺孢吸水链霉菌的应用分类与应用优势及实验室注意事项！