活死细胞染色实验全攻略：手把手教你获得完美结果！
小杨 / 2025-11-14 10:18:42
百欧博伟生物：在细胞生物学研究中，活死细胞染色是评估细胞活力的经典方法。今天，我们就来详细解析这一实验的全流程，帮你避开那些常见的“坑”。
一、实验前期准备
1、操作台准备
超净台紫外照射30分钟充分灭菌后，关闭紫外灯，打开风机，通风10分钟。随后用酒精棉球仔细擦拭台面，并点燃酒精灯，创造无菌操作环境。
2、试剂与材料检查
试剂盒组分：
Calcein-AM（干粉或溶液）
PI溶液
PBS缓冲液（注意： 需提前解冻）
实验耗材：
黑色/透明96孔板
移液枪（20μL与1000μL规格）
微量离心管（1.5mL）
二、实验步骤详解
1、细胞处理
当细胞密度达到90%时，接种于多孔板（如96孔板）。待细胞贴壁24小时后进行加药处理，再加药培养24小时。
关键细节：
观察细胞生长状态，吸弃旧培养基
使用预温的PBS轻柔清洗1-2次（避免细胞脱落）
96孔板每孔接种3k-5k细胞（过密会导致细胞卷边和假阳性）
铺板时采用“米”字法摇匀，确保细胞分布均匀——这直接关系到后续拍摄效果
2、染色工作液配制
严格按照试剂盒说明配制染色工作液，注意避光，且现用现配！
以碧云天试剂盒为例：
Calcein-AM : PI : 缓冲液 = 1:1:1000
即分别加入1.5μL AM、1.5μL PI和1.5mL缓冲液
3、染色孵育
根据不同孔板加入相应体积的染色剂：
6孔板：1mL
12孔板：500μL
24孔板：250μL
96孔板：100μL
加入染色剂后，37℃避光孵育15-30分钟。
4、洗涤与检测
洗涤步骤：
吸弃染色液
用PBS清洗一次（减少背景干扰）
技巧：PBS沿孔壁加入，轻晃孔板，静置1-2分钟后吸弃
观察检测：
荧光显微镜下观察
活细胞显绿色（激发/发射波长：494/517 nm）
死细胞显红色（激发/发射波长：535/617 nm）
注意：避免长时间曝光，防止荧光淬灭
染色效果的好坏往往取决于细节处理。PBS清洗时动作要轻柔，避免细胞脱落；观察时尽快完成，防止荧光淬灭影响结果判断。
掌握这些关键步骤，你就能获得清晰的活死细胞染色结果，为实验提供可靠的数据支持！
北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在
微生物菌种查询网中获得最优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！
下载附件
上一篇：液体石蜡保藏法的工作原理与操作流程及质量控制与应用！
下一篇：菌落选择的核心原则与操作步骤及影响因素与常见问题！