微生物菌种冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的操作规程！
小杨 / 2025-09-22 09:41:05
百欧博伟生物：微生物菌种冷冻干燥保藏是长期保存的首选方法（可保存数年至数十年），低温冷冻保藏（-20℃/-80℃）则更适合中短期保存或作为应急备份，两者核心都是通过低温和脱水降低微生物代谢活性，减少细胞损伤。
一、微生物菌种冷冻干燥保藏技术规程（长期保存）
冷冻干燥（冻干）通过“冻结 - 真空升华脱水”实现，关键是选择合适的保护剂、控制冻结速率和真空度，最大限度减少冰晶对细胞的破坏。
1、前期准备
菌种选择：需选择对数生长期的菌种，此时细胞活性高、抗逆性强。避免使用衰亡期菌种，否则存活率极低。
试剂与器具：
保护剂：根据菌种类型选择，常用配方如下表。
器具：冻干管（硬质玻璃，带密封塞）、移液管、培养皿、真空冷冻干燥机、超净工作台、高压灭菌锅。
器具灭菌：冻干管、移液管等需 121℃高压灭菌 20 分钟，烘干后备用；保护剂需过滤除菌（0.22μm 滤膜）或低压灭菌（115℃，15 分钟），避免高温破坏成分。
2、菌悬液制备（超净工作台内操作）
取对数生长期的菌种，用无菌生理盐水或无菌培养基轻轻冲洗培养物，收集到无菌离心管中。
3000-5000rpm 离心 10-15 分钟，弃上清液，保留菌体沉淀。
向沉淀中加入适量保护剂，轻轻吹打混匀，制成10^8 - 10^9 CFU/mL的菌悬液（浓度过低会导致复苏困难）。
3、分装与预冻结
用无菌移液管将菌悬液分装到冻干管中，每管装 1-2mL（液面高度不超过管高的 1/3，便于升华）。
将冻干管放入-80℃冰箱或液氮罐（气相区，-150℃以下）预冻结 2-4 小时，确保菌悬液完全冻结（避免后续真空升华时出现沸腾，导致菌体流失）。
4、冷冻干燥（核心步骤）
将预冻结的冻干管连接到真空冷冻干燥机的样品架上，确保密封良好。
启动冻干机，先抽真空至10-30Pa，然后开启加热板（温度控制在 0-5℃，缓慢升温，避免冰晶快速融化）。
冻干过程持续 8-24 小时（根据菌悬液体积调整），直至冻干管内物质呈疏松的白色粉末状，无明显水分（可用重量法判断：冻干后重量稳定，不再下降）。
5、密封与保存
冻干结束后，在真空状态下用火焰熔封冻干管（或用无菌橡胶塞密封，外层套铝盖），确保无漏气。
标记冻干管：注明菌种名称、菌株编号、冻干日期、操作人员。
保存条件：4℃冰箱（短期，1-2 年）或-20℃冰箱（长期，5-10 年），避免反复冻融。
6、复苏与质量检测
复苏：用无菌镊子敲碎冻干管，加入 1-2mL 无菌培养基，轻轻吹打溶解冻干物，取 0.1-0.2mL 涂布平板或接种液体培养基，37℃（或菌种最适温度）培养 18-24 小时。
质量检测：
存活率：计数平板上的菌落数，计算复苏后的存活率（需≥50%，否则视为保藏失败）。
纯度：观察菌落形态，镜检确认无杂菌污染；必要时进行生化试验或分子鉴定，确保菌种未发生变异。
二、微生物菌种低温冷冻保藏技术规程（中短期保存）
低温冷冻保藏通过低温（-20℃/-80℃）直接抑制微生物代谢，操作简单、成本低，但保存时间较短（-20℃约 6-12 个月，-80℃约 1-3 年），需添加保护剂防止细胞结冰损伤。
1、适用范围
适合细菌、酵母菌、真菌菌丝体或孢子，不适合对低温敏感的极端微生物（如嗜热菌）。
2、前期准备
器具：无菌冷冻管（聚丙烯材质，耐低温）、移液管、超净工作台、-20℃/-80℃冰箱。
3、操作步骤（超净工作台内）
菌悬液制备：同冷冻干燥步骤，取对数生长期菌种，用无菌生理盐水离心收集菌体，加入无菌保护剂，制成 10^8 - 10^9 CFU/mL 的菌悬液。
分装：将菌悬液分装到无菌冷冻管中，每管 1-1.5mL，盖紧盖子并标记（菌种名称、编号、保藏日期）。
梯度降温（关键！减少冰晶损伤）：
先将冷冻管放入4℃冰箱1 小时，让菌体适应低温。
转移至-20℃冰箱2-4 小时，使菌悬液缓慢冻结。
最终放入-80℃冰箱长期保存（若用 - 20℃冰箱，保存时间不超过 6 个月）。
（可选）若有程序降温仪，可设置“1℃/ 分钟”的降温速率，从 4℃降至 - 80℃，存活率更高。
4、复苏与注意事项
复苏：从 - 80℃冰箱取出冷冻管，立即放入37℃水浴锅中快速融化（1-2 分钟内完全融化，避免冰晶反复形成损伤细胞），然后按冻干复苏方法接种培养。
注意事项：
冷冻管取出后需一次性复苏完毕，禁止反复冻融（可分装多管，每次取 1 管使用）。
每 3-6 个月需抽样复苏检测，确认菌种活性和纯度，若存活率低于 30%，需重新制备保藏。
三、两种保藏技术对比
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