巧克力琼脂平板的核心原理与制备方法及具体操作步骤！
小杨 / 2025-09-17 10:50:01
巧克力琼脂平板（Chocolate Agar Plate）是实验室常用的营养丰富型培养基，因加热处理后血液中的血红蛋白释放，使培养基呈巧克力色而得名。它能为营养需求苛刻的细菌（如
脑膜炎球菌、
流感嗜血杆菌等）提供生长所需的 X 因子（原卟啉）和 V 因子（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD），广泛用于苛养菌的分离培养。以下是其具体制备方法，操作需遵循无菌操作规范，确保培养基无菌且成分比例准确。
一、核心原理
巧克力琼脂的关键是对脱纤维羊血（或马血）进行加热处理：通过 56~58℃的 “温和加热”，破坏红细胞释放血红蛋白（提供 X 因子），同时使血液中的 V 因子释放并保持活性（避免高温破坏 V 因子），最终与基础营养琼脂（如
哥伦比亚琼脂、
脑心浸液琼脂）混合，形成适合苛养菌生长的培养基。
二、材料准备
1、基础成分（以制备 1000mL 培养基为例，可按比例缩放）
成分名称 用量 作用说明
哥伦比亚琼脂基础 40~45g 提供碳水化合物、蛋白质、维生素等基础营养，是培养基的“骨架”
脱纤维羊血（或马血） 50~100mL 提供 X 因子（血红蛋白）和 V 因子，需新鲜、无溶血，避免使用牛血（含 V 因子抑制物）
无菌蒸馏水（或去离子水） 900~950mL 溶解基础琼脂，确保成分均匀分散
2、仪器与耗材
电子天平、pH 计、磁力搅拌器、恒温水浴锅（精度 ±1℃）
锥形瓶（2000mL，带棉塞或硅胶塞）、量筒（1000mL）
高压蒸汽灭菌器（121℃灭菌用）
无菌培养皿（直径 90mm，提前灭菌或一次性无菌）
无菌移液管（10mL、50mL）、酒精灯、无菌操作台
温度计（量程 0~100℃，用于监测加热温度）
三、具体制备步骤（分 6 步，核心是“加热处理血液”和“无菌倒平板”）
步骤 1：溶解基础琼脂，调整 pH
用电子天平准确称取 40~45g 哥伦比亚琼脂基础，放入 2000mL 锥形瓶中。
用量筒量取 900~950mL 无菌蒸馏水，倒入锥形瓶，轻轻摇匀（避免琼脂粘壁）。
将锥形瓶置于 磁力搅拌器上，60~70℃水浴加热（或直接用电炉小火加热，需不断搅拌），直至琼脂完全溶解（溶液澄清，无肉眼可见颗粒）。
用 pH 计检测溶液 pH，需调整至 7.2~7.4（若 pH 偏低，滴加 1mol/L NaOH；若偏高，滴加 1mol/L HCl，边加边搅拌，避免局部过酸 / 过碱）。
步骤 2：高压蒸汽灭菌（杀灭杂菌，避免污染）
向锥形瓶中补加无菌蒸馏水至 1000mL（加热溶解过程中会有水分蒸发，需补足体积，确保浓度准确）。
锥形瓶口塞紧棉塞（或硅胶塞），外包牛皮纸（防止灭菌时水汽进入），放入高压蒸汽灭菌器。
设定灭菌参数：121℃、103.4kPa（1.05kg/cm²）、灭菌 15~20 分钟（灭菌时间从达到设定温度开始计时，避免灭菌不彻底）。
灭菌结束后，关闭灭菌器，待压力降至 0、温度降至 80~90℃时，取出锥形瓶，置于无菌操作台旁的水浴锅中（60~70℃保温，防止琼脂凝固，备用）。
步骤 3：血液加热处理（关键步骤，释放 X/V 因子）
取出冷藏的 新鲜脱纤维羊血（提前在室温下放置 10~15 分钟，避免温差过大导致红细胞破裂），用量筒量取 50~100mL，倒入无菌烧杯中。
将烧杯放入 恒温水浴锅，设定温度 56~58℃，用温度计持续监测血液温度（核心：温度不可超过 58℃，否则会破坏 V 因子；不可低于 56℃，否则血红蛋白释放不充分）。
加热过程中，用无菌玻璃棒轻轻搅拌血液（避免局部过热），观察血液颜色变化：从鲜红色逐渐变为 暗棕色（巧克力色），此过程约 5~10 分钟（需持续监测，避免过度加热导致血液凝固）。
达到巧克力色后，立即将烧杯从水浴锅中取出，放入 室温水中冷却（快速降温至 45~50℃，防止持续加热破坏营养成分）。
步骤 4：混合基础琼脂与血液（无菌操作，避免污染）
将保温在 60~70℃的基础琼脂溶液（锥形瓶）转移至无菌操作台内，待其温度降至 45~50℃（用手背触碰锥形瓶外壁，不烫手即可，避免温度过高杀死血液中的营养成分，或过低导致琼脂提前凝固）。
在无菌操作下，用无菌移液管吸取 冷却后的巧克力色血液，缓慢倒入基础琼脂溶液中，边倒边轻轻摇匀（避免剧烈摇晃产生气泡，影响平板平整度）。
（可选）若需制备选择性巧克力琼脂，此时可加入抗生素添加剂（如万古霉素 5μg/mL、多粘菌素 B2.5μg/mL），轻轻摇匀（需严格按说明书控制浓度，避免抑制目标菌生长）。
步骤 5：倒平板（均匀分配，避免浪费）
在无菌操作台上，取出无菌培养皿（一次性或灭菌后的），打开皿盖（仅打开一条缝隙，避免外界杂菌落入），将混合好的培养基缓慢倒入培养皿中，每皿倒入 15~20mL（厚度约 3~4mm，过厚影响菌落观察，过薄易干裂）。
倒完后，轻轻晃动培养皿（顺时针或逆时针转动），使培养基均匀覆盖皿底，避免产生气泡或局部厚薄不均。
盖上皿盖，将培养皿平放在无菌操作台上，室温下静置 30~60 分钟（或放入 37℃培养箱中静置 20 分钟），待培养基完全凝固（凝固后表面光滑、无凹陷）。
步骤 6：质量检测与储存（确保培养基合格）
无菌性检测：取 1~2 个制备好的平板，不接种任何菌，放入 35~37℃培养箱中培养 24~48 小时，若平板表面无任何菌落生长，说明培养基无菌合格；若有菌落，需重新制备。
适用性检测：接种标准菌株（如
脑膜炎球菌 ATCC 13090），35~37℃、5% CO₂培养箱中培养 24 小时，若菌株生长良好（菌落呈圆形、光滑、无色透明），说明培养基营养合格。
储存：合格的平板需倒置（防止冷凝水滴落污染菌落），放入 4±2℃冰箱中储存，保质期一般为 7~14 天（若添加抗生素，保质期缩短至 3~5 天，需标注制备日期和失效日期）。
四、关键注意事项（避免制备失败的核心要点）
血液选择：优先使用脱纤维羊血，不可用牛血（牛血中含 V 因子抑制物，会抑制
流感嗜血杆菌、
脑膜炎球菌生长）；血液需新鲜（采集后 48 小时内使用），无溶血、无凝块。
温度控制：
血液加热：严格控制在 56~58℃，温度过高会破坏 V 因子，导致苛养菌无法生长；温度过低则血红蛋白释放不足，培养基颜色偏浅，营养不足。
基础琼脂与血液混合：基础琼脂温度需降至 45~50℃，过高会杀死血液中的营养成分，过低会导致琼脂提前凝固，无法均匀混合。
无菌操作：从灭菌后到倒平板的全过程需在无菌操作台上进行，避免空气中的杂菌污染；移液管、培养皿等耗材需提前灭菌，操作时避免手触碰皿口和培养基表面。
pH 调整：pH 需严格控制在 7.2~7.4，过酸或过碱会抑制目标菌生长（如脑膜炎球菌在偏酸性环境中生长不良）。
通过以上步骤，即可制备出营养充足、无菌合格的巧克力琼脂平板，适用于
脑膜炎球菌、
流感嗜血杆菌等苛养菌的分离、培养和鉴定。
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