凝结芽孢杆菌计数培养基的原理与使用方法及操作步骤！
小杨 / 2025-07-05 09:52:05
凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）计数通常使用特定的选择性培养基，最常用的是 TSC 培养基或其改良版本。该培养基的原理在于利用目标菌的生理特性（特别是其芽孢的耐热性和代谢特性）来抑制杂菌并促进目标菌生长。
一、原理
芽孢耐热性：凝结芽孢杆菌能形成耐热的芽孢。样品经过适当的热处理（如 80°C 或 85°C 水浴）可以杀死样品中绝大多数的营养细胞（包括其他非芽孢菌和部分不耐热的芽孢菌），而凝结芽孢杆菌的芽孢能存活下来。
亚硫酸盐还原能力：凝结芽孢杆菌在厌氧条件下生长时，能将培养基中的亚硫酸盐还原成硫化物。
黑色沉淀形成：产生的硫化物与培养基中的铁盐反应，生成不溶性的黑色硫化亚铁（FeS）沉淀。这是识别目标菌落最关键的标志。
选择性抑制：
D-环丝氨酸（D-Cycloserine）：这是TSC培养基的核心选择性成分。它是一种抗生素，能有效抑制绝大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌（包括其他常见的芽孢杆菌如
蜡样芽孢杆菌）的营养细胞生长。但凝结芽孢杆菌的芽孢对D-环丝氨酸具有相对抗性，能在其存在下萌发并生长。
亚硫酸盐：除了作为指示系统的底物外，一定浓度的亚硫酸盐对部分杂菌也有一定的抑制作用。
热处理：如前所述，预先热处理样品是极其重要的一步选择性措施，极大地降低了背景杂菌的数量。
总结原理：通过热处理杀死营养细胞，利用D-环丝氨酸选择性抑制绝大多数残留或可能污染的杂菌（尤其是其他芽孢杆菌），在厌氧条件下培养后，凝结芽孢杆菌的芽孢萌发、生长，并通过还原亚硫酸盐产生黑色硫化亚铁沉淀，形成特征性的黑色菌落（通常带有黑色晕环或整个菌落变黑），从而进行计数。
二、使用方法 (基于 GB 4789.14-2014 食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽孢杆菌检验 附录B 凝结芽孢杆菌的计数)
重要提示：具体操作请务必遵循你所执行的最新版本国家标准、行业标准或药典规定。细节（如稀释液、热处理温度/时间、培养时间）可能因标准更新或具体应用（食品、药品、益生菌产品）而略有不同。
主要材料与试剂
TSC 培养基基础：含胰酪胨、大豆胨、酵母浸粉、亚硫酸钠、柠檬酸铁铵等。
D-环丝氨酸溶液：按标准要求浓度配制（通常终浓度为400mg/L）。
无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液：用于样品稀释。
无菌平皿、移液管/移液器及枪头、均质袋/均质杯、水浴锅、厌氧培养装置（如厌氧罐/袋+产气包）、恒温培养箱等。
操作步骤
样品制备与稀释：
无菌称取或量取一定量（通常25g或25mL）样品。
加入适量的无菌稀释液，在均质器中充分均质1-2分钟，制成1:10的样品匀液。
用无菌移液管或移液器吸取1:10匀液1mL，加入9mL无菌稀释液中，充分混匀，制成1:100的稀释液。
按此方法，根据需要制备一系列十倍递增稀释度。选择2-3个适宜稀释度进行后续操作。
热处理 (关键步骤)：
将每个选定的稀释度样品匀液（注意：是稀释后的匀液，不是原始样品）置于80°C ± 1°C 或 85°C ± 1°C（具体温度依据所执行的标准）的水浴中。
精确计时加热 10分钟。此步骤杀死营养细胞，保留凝结芽孢杆菌芽孢。
立即将处理后的样品匀液冷却至室温（如置于冰水浴中）。
倾注平板：
无菌操作，吸取热处理并冷却后的各稀释度样品匀液1mL，分别加入无菌平皿中。
倾注TSC培养基：
将制备好的TSC基础培养基融化并冷却至45-50°C。
临用前，按标准要求加入适量过滤除菌的D-环丝氨酸溶液，轻轻摇匀（避免产生气泡）。
立即将约15-20mL含D-环丝氨酸的TSC培养基倾注于每个已加入样液的平皿中。
小心旋转平皿，使样液与培养基充分混匀，避免产生气泡。静置待其凝固。
厌氧培养：
待琼脂完全凝固后，将平板倒置。
放入厌氧培养装置（如厌氧罐或厌氧袋）中。
按照厌氧装置的要求（通常是加入产气袋或使用气体置换法）创造厌氧环境。
将厌氧装置置于 36°C ± 1°C 的恒温培养箱中。
培养 48小时 ± 2小时。
菌落计数：
培养结束后，取出平板。
选择菌落数在15-150 CFU之间的平板进行计数（若所有稀释度均小于15，则记录最低稀释度的菌落数；若所有稀释度均大于150，则记录最高稀释度的菌落数或记为“多不可计”）。
目标菌落特征：凝结芽孢杆菌在TSC培养基上呈现黑色或棕黑色菌落，菌落周围通常有黑色沉淀环（晕环），有时整个菌落呈黑色。这是基于其还原亚硫酸盐产生FeS沉淀的特性。
注意：计数时，只计数符合上述典型特征的黑色（带晕环）菌落。非黑色的菌落通常是杂菌或非目标菌，不应计数。
结果计算与报告：
根据计数结果和相应的稀释倍数，计算每克（或每毫升）样品中凝结芽孢杆菌的数量（CFU/g 或 CFU/mL）。
报告结果时，通常以科学计数法表示（如 1.5 × 10⁵ CFU/g）。
三、关键注意事项
标准依据：严格遵循你所执行的最新有效标准。温度、时间、培养基配方、D-环丝氨酸浓度等细节都可能随标准更新而变化。
热处理：温度（80°C 或 85°C）和时间（10分钟）必须精确控制。温度过低或时间过短无法有效杀死营养细胞；温度过高或时间过长可能损伤甚至杀死目标芽孢。水浴锅温度需校准。
D-环丝氨酸：必须过滤除菌，并在倾注培养基前临用加入。其浓度对选择性至关重要。
厌氧培养：确保厌氧装置密封良好且产气正常，创造有效的厌氧环境是目标菌落产生黑色沉淀的必要条件。
培养基温度：倾注时培养基温度不能过高（>50°C可能烫伤芽孢），也不能过低（<45°C可能提前凝固，混合不均）。
菌落识别：准确识别典型黑色带晕环的菌落是正确计数的关键。需由有经验的人员进行操作或进行菌落确证。
无菌操作：整个实验过程必须严格遵守无菌操作规程，防止污染。
平行试验：通常每个稀释度做两个或三个平行平板，以提高结果的准确性和可靠性。
培养基质量控制：使用前应进行培养基的质量控制，确保其支持目标菌生长并抑制杂菌。
通过严格遵循TSC培养基的原理和标准化的使用方法，可以相对准确地定量检测样品（特别是食品、益生菌制品等）中凝结芽孢杆菌的数量。
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