细胞培养方法之传代培养操作步骤与实验技巧及注意事项！
小杨 / 2025-06-12 09:55:09
百欧博伟生物：细胞培养是生物医学研究中最基础也是最重要的实验技术之一。它涉及在体外模拟体内环境，使细胞在人工条件下生长、增殖和维持。传代培养是当细胞在培养容器中生长至一定密度时，将其分瓶接种，以提供更多生长空间并维持细胞活性的过程。
一、细胞培养基本要素与方法
1、无菌环境：
生物安全柜 (BSC)：所有开放操作必须在经认证的BSC中进行，提供无菌工作区并保护操作者和环境。
无菌技术：严格遵循无菌操作规程：穿戴实验服、手套、口罩；试剂、耗材灭菌；避免开口暴露过久；勤用75%酒精消毒手、台面和物品表面；使用无菌枪头、移液管。
培养基和试剂：必须无菌（通常购买已灭菌产品或自行过滤除菌）。
2、培养环境模拟：
温度：绝大多数哺乳动物细胞在 37°C 下培养。
气体环境：大多数细胞需要 5% CO₂ 来维持培养基的pH值（通常在7.2-7.4）。使用带有CO₂控制的恒温培养箱。
湿度：培养箱需维持高湿度（>95%），防止培养基蒸发。通常使用无菌水盘。
培养基：
基础培养基：提供基本营养物质（氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖）。
血清：最常用的是胎牛血清，提供生长因子、激素、粘附因子和营养物质。浓度通常为5-20%。
添加剂：抗生素（如链霉素）和抗真菌剂（如两性霉素B或制霉菌素）用于防止污染（但无法替代无菌操作）；有时需添加L-谷氨酰胺（细胞重要能量来源，不稳定，需定期补充）、非必需氨基酸、HEPES缓冲液（pH稳定）等。
培养容器：根据不同需求选择：培养瓶（T25, T75, T175）、培养皿（35mm, 60mm, 100mm）、多孔板（6孔，12孔，24孔，96孔等）。材质通常是经表面处理的聚苯乙烯塑料，利于细胞贴附。
3、细胞类型：
贴壁细胞：需要附着在固体表面生长。传代时需用酶（如胰蛋白酶）消化使其从培养皿/瓶底脱落。
悬浮细胞：在培养基中自由漂浮生长。传代时直接稀释或离心收集即可。
二、贴壁细胞传代培养操作步骤（以常用胰蛋白酶消化法为例）
（一）准备工作：
1、预热：将所需体积的完全培养基（含血清）、PBS（磷酸盐缓冲液，无钙镁）、胰蛋白酶-EDTA溶液置于37°C水浴或培养箱中预热15-30分钟。冷的溶液会降低消化效率并刺激细胞。
2、生物安全柜准备：开启BSC通风和紫外灯至少15-30分钟。关闭紫外灯，开启照明和风机。用75%酒精彻底擦拭内表面。准备好无菌移液器、枪头、废液缸、离心管、新培养瓶/皿、标记笔。
3、观察细胞：将原培养瓶/皿从培养箱取出，在倒置显微镜下观察细胞状态和密度。细胞应处于对数生长期后期（融合度约80-90%），形态健康，无污染迹象（浑浊、漂浮物、菌丝、异常pH变化）。这是传代的最佳时机。
（二）操作步骤：
1、移除旧培养基：
小心地将含有旧培养基的培养瓶/皿转移到BSC内。
用无菌移液管或真空泵（带无菌吸头）轻柔地吸弃旧培养基。避免触及瓶底细胞层。
2、PBS洗涤：
向培养瓶/皿中加入适量预热的无菌PBS（体积通常能覆盖细胞层即可，如T25瓶约3-5ml）。
轻轻晃动或倾斜容器，使PBS润洗整个细胞生长面。
吸弃PBS。此步骤旨在去除残留的血清（血清含有胰蛋白酶抑制剂），并洗去死细胞碎片。
3、加入胰蛋白酶-EDTA：
加入适量预热的胰蛋白酶-EDTA溶液（覆盖细胞层即可，如T25瓶约1-2ml）。确保溶液均匀覆盖细胞。
轻轻晃动容器，使溶液均匀分布。
消化：将培养瓶/皿放回37°C培养箱中，或置于BSC内室温下（37°C效果更快更均匀）。消化时间需密切观察（通常30秒-5分钟，取决于细胞类型和胰酶活性），切勿过度消化。
观察判断：显微镜下观察或肉眼倾斜观察。当大部分细胞变圆、边缘发亮、有脱落趋势（轻拍瓶壁可见“沙雾”状脱落）时，立即终止消化。切勿等到所有细胞完全脱落！
4、终止消化：
迅速将培养瓶/皿移回BSC。
加入含血清的完全培养基（体积通常是胰酶体积的2-5倍，如T25瓶加入4-8ml）。血清中的抑制剂能快速中和胰蛋白酶活性。
用移液管轻柔吹打细胞层表面（沿瓶壁或皿底不同方向反复吹吸数次），使贴壁细胞完全脱离并分散成单细胞悬液。吹打动作要轻柔，避免产生过多气泡损伤细胞。
5、收集细胞悬液：
将含有细胞的培养基（即细胞悬液）转移至一个无菌的离心管中。
6、离心：
平衡离心管后，放入离心机。
以相对较低的转速离心（通常1000-1200 rpm / 约150-200 g）5-10分钟。目的是将细胞沉淀下来，去除含有胰酶和旧培养基的上清液。
7、重悬细胞：
离心结束后，小心取出离心管，避免扰动沉淀。
用无菌移液管彻底吸弃上清液。
加入新鲜预热的完全培养基（体积根据后续分瓶需求确定）。
用移液管轻柔吹打或反复抽吸（避免气泡），使细胞沉淀完全、均匀地重悬成单细胞悬液。吹打次数不宜过多过猛。
8、细胞计数与活力检测 (可选但推荐)：
取少量细胞悬液，用台盼蓝染色法或自动细胞计数仪进行计数，并计算细胞活力（活细胞百分比）。
根据计数结果调整最终接种密度。
9、分瓶接种：
根据实验需求（扩增或维持）和细胞类型，将计算好体积的细胞悬液加入新的、标记好信息（细胞名称、代次、日期、操作者）的培养瓶/皿中。
加入新鲜预热的完全培养基至所需工作体积（如T25瓶通常8-10ml）。
轻柔晃动或十字法（前后左右）晃动容器，使细胞均匀分布。
10、培养：
盖紧瓶盖或盖上皿盖。
将新接种的培养瓶/皿小心放入37°C，5% CO₂，饱和湿度的恒温培养箱中。
通常24小时后观察细胞贴壁和生长情况。
三、悬浮细胞传代培养操作步骤
悬浮细胞传代相对简单，无需消化步骤：
观察细胞：同贴壁细胞。
收集细胞：将培养瓶/皿中的细胞悬液轻轻混匀，转移至无菌离心管中。
离心：同贴壁细胞（1000-1200 rpm，5-10分钟）。
移除上清：吸弃含有旧培养基的上清液。
重悬：加入适量新鲜预热的完全培养基，轻柔吹打重悬细胞。
计数与活力检测 (可选但推荐)： 同贴壁细胞。
分瓶接种：根据计数结果，将所需体积的细胞悬液加入新的、标记好的培养容器中，补加新鲜培养基至工作体积。
培养：同贴壁细胞。
关键注意事项：
无菌！无菌！无菌！这是细胞培养成功的首要前提。任何疏忽都可能导致污染（细菌、真菌、支原体），导致实验失败。
轻柔操作：吹打、离心、移液等动作务必轻柔，避免机械损伤细胞。
严格控制消化时间：过度消化会严重损伤细胞。
环境稳定：确保培养箱温度、CO₂浓度、湿度恒定。频繁开关门会影响稳定性。
定期观察：每天或隔天观察细胞形态、密度、培养基颜色（pH指示）及有无污染迹象。
及时传代：细胞过密（100%融合或悬浮细胞密度过高）会导致接触抑制、营养耗竭、代谢废物积累，影响细胞状态甚至死亡。不要在细胞长满后才传代。
记录：详细记录细胞名称、来源、代数、传代日期、操作步骤、培养基批次、任何异常情况等。这对实验可重复性和问题追踪至关重要。
选择合适的传代比例/密度：根据细胞生长速度和实验目的决定分瓶比例（如1:2, 1:3, 1:4, 1:10）或接种密度（如细胞数/cm² 或 细胞数/ml）。
血清批次：不同批次的血清质量可能有差异。对于关键实验，建议测试不同批次血清或使用同一批次血清。
定期检测支原体：支原体污染非常普遍且难以察觉，会严重影响实验结果。建议定期（如每1-2个月）进行支原体检测。
实验技巧：
预热充分：确保所有接触细胞的液体都预热至37°C。
胰酶浓度与时间：摸索适合自己细胞系的最佳胰酶浓度和消化时间。有些细胞可能需要更低浓度或更短时间。
吹打技巧：吹打时枪头抵住瓶壁或管壁，避免直接冲击细胞沉淀。吹吸力度适中，次数以细胞分散均匀为准。
避免气泡：剧烈吹打或移液容易产生气泡，损伤细胞。
细胞计数：台盼蓝染色时，活细胞排斥染料不着色（透明），死细胞着蓝色。计数应在染色后几分钟内完成。
冻存备份：定期冻存低代数的健康细胞作为备份，防止因污染或意外丢失细胞株。
掌握细胞培养和传代技术需要理论学习和大量的实践操作。严格按照规程操作，注意细节，保持耐心和细心，是成功的关键。
北京百欧博伟生物技术有限公司拥有Biolog微生物鉴定系统，超低温冰箱，生物安全柜等仪器设备可进行对微生物分离、鉴定等常规的分子实验研究。对我国生命科学研究、生物技术创新和产业发展的需求进行积极的面对社会乃至国外收集保藏提供微生物菌种资源。在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供微生物物种资源、基因资源、信息资源和专业技术服务。
除此之外，我们还拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在
微生物菌种查询网中获得最优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！
下载附件
上一篇：平板菌落集中在一起的原因是什么及解决方法有哪些？
下一篇：无色杆菌属的基本特征与应用价值及培养与保藏方法！