组织和细胞蛋白提取及定量的常规流程与操作步骤！
小杨 / 2025-05-21 09:49:40
一、组织样本蛋白提取
1、实验前准备
试剂：预冷的裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸盐缓冲液（PBS）、液氮。
仪器：匀浆器/研磨仪、低温离心机、冰盒、涡旋仪。
样本处理：新鲜组织迅速用液氮速冻，保存于-80℃或立即处理。
2、操作步骤
组织解冻与称量
取50-100 mg组织，剪碎后置于预冷研钵中，加入液氮快速研磨成粉末。
裂解
加入1 mL裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30分钟，间歇涡旋混匀。
匀浆
使用超声破碎仪或组织匀浆器进一步破碎组织（冰上操作，避免产热）。
离心
4℃、12,000 ×g 离心15分钟，取上清（含可溶性蛋白）。
分装保存
分装后-80℃保存，避免反复冻融。
二、细胞样本蛋白提取
1、实验前准备
试剂：预冷裂解液（RIPA）、蛋白酶抑制剂、PBS（含EDTA）、胰酶（贴壁细胞）。
仪器：细胞刮、离心管、低温离心机。
2、操作步骤
细胞收集
贴壁细胞：PBS洗涤后刮取或用胰酶消化（终止后离心收集）。
悬浮细胞：直接离心（1,000 ×g，5分钟）收集。
裂解
每1×10⁶细胞加入100-200 μL裂解液（含抑制剂），冰上裂解30分钟，间歇涡旋。
离心
4℃、12,000 ×g 离心15分钟，取上清。
保存
分装后-80℃保存。
三、蛋白定量
1、试剂与仪器
试剂：BCA试剂盒（含标准品BSA）、PBS或裂解液。
仪器：酶标仪、96孔板、微量移液器。
2、操作步骤
标准曲线制备
用BSA标准品（0.2-2 mg/mL）按梯度稀释（如0、0.2、0.5、1、1.5、2 mg/mL）。
样品稀释
将待测蛋白样品用PBS或裂解液稀释至标准曲线范围内（通常稀释5-10倍）。
反应体系
每孔加入25 μL标准品/样品 + 200 μL BCA工作液，37℃孵育30分钟。
检测吸光度
用酶标仪测定562 nm处吸光度（OD值）。
计算浓度
根据标准曲线计算样品浓度，公式：
蛋白浓度（μg/μL）=（稀释后浓度 × 稀释倍数） / 1000
四、注意事项
低温操作：全程冰上操作，避免蛋白降解。
抑制剂使用：裂解液中需添加蛋白酶/磷酸酶抑制剂（根据实验需求）。
避免污染：使用无核酸酶/蛋白酶污染的离心管。
线性范围：确保样品OD值在标准曲线线性范围内。
样本保存：长期保存分装于-80℃，短期（1周）可存于-20℃。
五、常见问题
低浓度：增加样本量或减少裂解液体积。
高背景：离心后取上清避免吸入沉淀。
数据偏差：重复测定3次取平均值。
通过上述流程可获得高纯度蛋白样本并准确测定浓度，为下游实验奠定基础。
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