小鼠卵巢颗粒细胞永生化的培养操作规程！
小杨 / 2024-03-26 09:13:12
一、产品信息
规格：1×10⁶Cells/T25培养瓶
细胞信息：永生化细胞
用途：（免疫荧光鉴定）
注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）
二、细胞详述
卵巢是雌性动物的生殖器官。卵巢的功能是产生卵以及类固醇激素。它的外表有一层上皮组织，其下方有薄层的结缔组织。卵巢的内部结构可分为皮质和髓质。皮质位于卵巢的周围部分，主要由卵泡和结缔组织构成；髓质位于中央，由疏松结缔组织构成，其中有许多血管、淋巴管和神经。
卵巢是分泌雌激素的主要器官。卵巢分泌的雌激素主要是雌二醇。卵巢中颗粒细胞是合成雌激素的场所。其产生过程是使雄烯二酮转变成雌激素：内膜细胞在LH的作用下，使胆固醇转变为雄烯二酮；颗粒细胞在FSH的作用，发育过程中产生芳香化酶，它使雄烯二酮转变成雌激素。形成的雌激素分泌到卵泡液和血液中。
该细胞通过慢病毒转染的方式携带SV40基因。
注意事项：收到细胞后第一次传代建议1：2传代，充液培养基是维持培养基，不能用来培养细胞。
三、细胞特性
1)组织来源于实验动物的正常卵巢组织。
2)细胞鉴定：卵泡刺激素受体(FSHR)免疫荧光染色为阳性。
3)经鉴定细胞纯度高于90%。
4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。
5)细胞生长方式：不规则细胞，贴壁培养。
四、推荐培养基
我们推荐使用原代卵巢颗粒细胞培养体系作为体外培养原代卵巢颗粒细胞的培养基。
名称 体积 浓度 保存条件
原代卵巢颗粒细胞基础培养基 500ml 1× 4℃、避光
原代卵巢颗粒细胞培养添加剂 5ml 100× -20℃、避光
胎牛血清（FBS） 50ml 终浓度10% -20℃、避光
双抗（青霉素/链霉素，P/S） 5ml 100× -20℃、避光
五、产品的运输和保存
视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。
1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。
2T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。
六、产品使用
（1）本产品仅能用于科研
（2）本产品未通过直接用于活体动物和人的审核
（3）本产品未通过用于活体诊断的审核
七、细胞培养步骤
1、培养基及培养冻存条件准备：
注意：客户收到细胞后按照下面的要求操作：培养瓶里面的培养液是不含药物的。待细胞长到 70-80%的汇合度时，去掉培养液，加入含 16ug/ml 药物的培养液，放入培养箱，这段时间可能会有小部分细胞悬浮起来，但是不要紧，通过换液可以去掉，下面的细胞待长满就可以消化传瓶了，这时可以一直用含药培养液来消化培养细胞，一两代之后可以将药物浓度提高到 20ug/ml，含药培养液用于细胞培养都没问题的，冻存的时候就不要在冻存液里面加药物了。
1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；添加20ug/ml 5-FLU；双抗，1%。
2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
2、细胞处理：
1）冻存细胞的复苏：
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
3）细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：
1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
3、轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
下面T25瓶为例；
1、细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.
2、1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。
3、将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。
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