一、背景
BRL细胞是大鼠肝细胞组织来源是肝脏组织，大鼠肝细胞BRL属于上皮细胞样的贴壁生长细胞。培养用培养基为DMEM(PM150210)+10%FBS(164210-500)+1%P/S(PB180120)，推荐的传代比例为1:2-1:4，推荐换液频率为2~3次每周。
收到细胞以后，用75%酒精喷洒整个管子消毒后放到超菌台内，严格无菌操作；然后将小管细胞转移至T25培养瓶或6cm培养皿（不需要离心），加入5ml左右含FBS的培养基均匀，放入培养箱过夜培养后查看细胞汇合度：若未超过80%汇合度，换液继续培养，根据情况传代或者冻存。若超过80%汇合度，可直接进行传代（细胞贴壁处理方法）。
二、具体步骤如下
1、弃去培养液，用不含钙、镁离子的PBS洗1-2次。
2、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒转放于37℃培养箱1-3分钟预热，然后将培养瓶翻过来让胰酶与细胞面接触大约10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。
3、按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。如果没有特别说明，收到细胞后的第一次传代一般是一传三。
三、应用
BRL细胞可以用于铁死亡在甲基汞诱导大鼠原代星形胶质细胞和BRL细胞毒性中的作用研究：
选用原代大鼠星形胶质细胞(Astrocyte,AST)和正常大鼠肝细胞(Buffalo Rat Liver,BRL)为研究对象,探索铁死亡在MeHg诱导神经损伤和肝损伤中的作用,为治疗MeHg暴露诱发的机体损伤提供一个新的靶点。
方法：不同剂量的MeHg(0、1、2.5、5、10μM)分别处理AST和BRL细胞不同时间(0、0.5、3、6 h),四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验测量细胞活性;不同剂量的MeHg(0、1、2.5、5、10μM)分别处理AST和BRL细胞3 h,乳酸脱氢酶释放实验(Lactate dehydrogenase,LDH)测定细胞毒性。Ferro Orange荧光探针检测细胞内铁离子含量。免疫印迹法(western blot)测定细胞内铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPx4),谷氨酸-胱氨酸共转运体(Cystine/glutamate transporter,system XC~),铁蛋白重链1(Ferritin heavy chain 1,FTH1)的表达;微孔板法测量两种细胞内还原性谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量;流式细胞仪测定细胞内的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和脂质活性氧(Lipid reactive oxygen species,Lipid ROS)水平。
选择两种经典的铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)和去铁胺(Deferoxamine,DFO)预处理AST和BRL细胞2 h后与MeHg共处理3 h,对上述指标进行检测。结果:MeHg以时间-剂量依赖的形式降低AST和BRL细胞活性;MeHg处理可增加LDH释放率以及形态学的损伤。MeHg可增加AST和BRL细胞内的铁离子含量;MeHg处理影响两株细胞铁代谢相关蛋白的表达如抑制FTH1的表达;MeHg可抑制AST和BRL细胞内GPx4表达而没有明显地影响x CT的表达;MeHg降低AST内还原性GSH的含量而代偿性地增加BRL细胞内GSH的含量;补充外源性的GSH可以减轻MeHg所诱导的细胞毒性;MeHg可增加AST和BRL细胞内ROS以及Lipid ROS的产生。
铁死亡抑制剂DFO和Fer-1干预可缓解MeHg所致AST和BRL细胞活性的降低。铁死亡抑制剂DFO降低两种细胞内MeHg诱导的铁离子的增加。铁死亡抑制剂DFO和Fer-1可升高MeHg诱导的AST细胞内GSH含量。铁死亡抑制剂DFO和Fer-1上调MeHg诱导的AST和BRL细胞GPx4蛋白表达,仍然没有明显地影响x CT的表达。铁死亡抑制剂DFO和Fer-1明显地抑制MeHg诱导的两种细胞ROS和Lipid ROS的积累。结论:MeHg可诱导AST细胞和BRL细胞发生铁死亡。
MeHg诱导的该细胞死亡与铁代谢和氧化还原紊乱相关。铁死亡抑制剂DFO和Fer-1可以拮抗MeHg诱导的这种死亡。这进一步证实了铁死亡在MeHg诱导细胞损伤中的作用。这提醒我们拮抗铁死亡可能成为一个MeHg中毒治疗的新靶点,为MeHg的治疗提供了一个新的方向。
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