一、背景
人乳腺上皮细胞分离自乳腺组织；乳腺是复管泡状皮肤腺，主要由腺上皮细胞组成，并具有特殊的泌乳功能。在妊娠期，导管末梢发育成腺泡；近年来的许多研究都表明乳腺癌、乳腺炎等的发生都与乳腺上皮细胞（MEC）有密切联系，体外分离培养MECs即成为研究开展的关键步骤。乳腺是乳房的腺体组织，乳腺由导管和腺泡组成，腺泡是分泌乳汁的重要部分。乳腺的正常发育是由体内激素和局部合成的生长因子共同调控，其中乳腺表达的生长因子对乳腺上皮细胞的增殖、分化、凋亡产生极大的影响。乳腺上皮细胞分离自分娩后3-5天的乳腺组织，为贴壁生长型细胞，呈多角形、圆形以及短梭形；乳腺上皮细胞主要功能即生乳功能。
乳腺上皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10^5cells/瓶；细胞经Cytokeratin-18免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
二、人乳腺上皮细胞的培养操作
1)复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2)细胞传代：如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3)细胞冻存：待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。
下面T25瓶为类;
1.细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗一遍后加入1ml胰酶,细胞变圆脱落后,加入1ml含血清的培养基终止消化,可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞,根据细胞数量加入血清和DMSO,轻轻混匀,DMSO终浓度为10%,细胞密度不低于1x106/ml,每支冻存管冻存1ml细胞悬液,注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
人乳腺上皮细胞可以用于Kv1.5基因敲低对人乳腺上皮细胞增殖及Akt信号通路的影响：
利用RNAi技术建立Kv1.5基因敲低的稳定传代细胞模型MCF10AKv1.5(-),采用细胞计数法、免疫印迹、免疫荧光等方法研究Kv1.5在乳腺细胞信号转导和增殖过程中的作用及Kv1.5与Cav-1的相互作用关系,旨在探讨Cav-1与Kv1.5相互作用调节增殖相关信号通路控制乳腺上皮细胞增殖的机制。
结果：
(1)利用RNAi技术建立了Kv1.5基因敲低的人乳腺上皮细胞模型MCF10AKv1.5(-),发现Kv1.5基因敲低后,细胞倍增时间延长,PCNA蛋白表达明显下调,细胞增殖受到抑制。
(2)利用免疫印迹杂交技术研究Kv1.5基因敲低对MAPK和Akt通路激活的影响,发现Kv1.5基因敲低显著抑制MCF10A细胞内Akt信号通路的激活,促进MAPK与Akt信号通路的交叉对话。
(3)利用Kv1.5基因敲低的细胞模型MCF10AKv1.5(-)和Cav-1基因敲低的细胞模型MCF10ACE研究Kv1.5与Cav-1之间的相互作用,发现MCF10A细胞内Cav-1与Kv1.5相互作用共同分布于胞膜窖,Cav-1基因敲低抑制Kv1.5在膜上的表达和分布。
结论：Kv1.5基因敲低抑制人乳腺上皮细胞MCF10A增殖,并通过与Cav-1相互作用抑制Akt信号通路的激活。
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