一、背景
大鼠肝窦内皮细胞分离自肝脏组织；采用混合酶灌流消化、反复低速离心、密度梯度离心法，并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来；细胞经Dil-Ac-LDL免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
肝窦内皮细胞（SEC）是肝脏内所占比例最高的非实质细胞，位于肝窦腔与肝细胞之间，具有物质转运、吞噬、抗原提呈、免疫耐受等功能。
SEC由于拥有一般细胞所没有的窗孔结构、细胞间连结松散、内皮下缺少基底膜而使其具有高度通透性，从而达到快速交换各种大小分子的目的。肝在遭到多种病原侵袭时，肝窦内皮细胞窗孔逐渐减少或消失，内皮下基膜形成，产生类似于连续型毛细血管的结构，这一过程称为肝窦毛细血管化。它由多种因素引起，其过程极复杂，在多种肝病的发病前期阶段均有出现，近年来受到广泛关注。
二、大鼠肝窦内皮细胞的复苏与铺板
1、将15ml离心管插入盛有足量碎冰的冰盒中，紫外消毒15min；4℃预冷离心机。
2、复苏培养基放碎冰中充分预冷，铺板培养基放入38℃恒温水浴锅中充分预热。
3、将冻存的细胞从冷藏位置迅速转移至38℃恒温水浴锅中。尽可能多的浸入38℃水中，顺时针水平摇动，但必须确保冻存管管盖保持在水面以上。
4、解冻冻存管约90-120s，至冻存管中只有少量碎冰漂浮即可。
5、用75%酒精消毒冻存管，并将其转移到生物安全柜。
6、用宽口枪头将大鼠肝窦内皮细胞重悬（轻轻吹打2次），并转移至预冷的15ml离心管中（注意：冻存管与枪头上残留细胞，可用1ml复苏培养基清洗冻存管与枪头）。
7、向细胞悬液逐滴加入预冷复苏培养基，每1ml细胞悬液加入10ml复苏培养基（注意：前3ml要缓慢逐滴加入并轻微摇晃，后面7ml可加快速度），最后轻微上下颠倒1次混匀。
8、300×g，4℃离心5min，去上清并用培养基重悬。
9、沉淀的细胞用肝窦内皮细胞培养基重悬并定容至4ml，用台盼蓝排除法测定细胞的存活率和细胞总量。
10、将细胞按3×104cells/cm2接种至胶原包被培养板中。摇匀，在37℃/5%CO2培养箱中培养，24h后换液。
三、大鼠肝窦内皮细胞培养与传代
1、大鼠肝窦内皮细胞融合度达到80%时可进行传代。
2、提前将培养基、PBS、胰酶放入37℃水浴锅内预热，用75%酒精擦拭后再放入超净台内。
3、吸除旧培养液，加少量PBS润洗细胞，适量胰酶，使加入的胰酶能盖住细胞，37℃孵育，约2~3min。
4、显微镜下观察，待贴壁细胞间间隙变大、细胞趋于圆形但还未漂起时弃去胰酶，加入新鲜肝窦内皮细胞培养基，晃动细胞瓶，终止胰酶作用，用吸管小心吹打贴壁的细胞，制成细胞悬液（控制吹打的力度，避免产生大量的气泡）。
5、300×g，室温离心5min，去上清并用培养基重悬。
6、将细胞悬液按3×104cells/cm2接种到新的胶原包被培养瓶/板内，置37℃/5%CO2培养箱培养，隔天观察贴壁生长情况。
四、应用
大鼠肝窦内皮细胞可以用于天麻素调控p38 MAPK/Nrf2/HO-1通路减轻小鼠肝窦内皮细胞氧化损伤的机制研究：
探讨GSTD在LSECs氧化损伤中的保护作用及其分子机制,为临床HIRI的防治提供理论依据。
方法：首先使用1mM H2O2构建LSECs的氧化应激模型,同时给予1、10及50μM GSTD处理细胞,通过检测ROS、MDA的含量,评价了GSTD在LSECs氧化应激过程中的缓解作用;通过TUNEL法、Annexin V-FITC-PI双染法检测细胞凋亡,观察GSTD处理对H202诱导的LSECs凋亡的影响,并通过western blot检测凋亡相关蛋白表达;其次,我们使用10mM的SB 203580和1mM的Znpp分别处理细胞,通过western blot检测了p38MAPK/Nrf2/HO-1这一氧化应激相关通路的蛋白变化,并进行了氧化应激及细胞凋亡相关指标的检测;
进一步构建了Nrf2过表达及Nrf2和HO-1的siRNA敲减细胞模型,通过核质分离和免疫共沉淀检测Nrf2在细胞质和细胞核中的变化,验证GSTD通过p38MAPK调控Nrf2/HO-1在抗氧化损伤过程中的作用;
此外,GSTD腹腔灌注后建立小鼠HIRI模型,通过检测血清中AST、ALT水平及肝脏组织HE染色,观察GSTD对肝脏损伤的保护作用;通过TUNEL法检测细胞凋亡情况;检测小鼠组织中MDA和SOD的含量;RT-PCR和Western blot分别检测了小鼠肝脏组织中HO-1、Nrf2、IL-6和TNF-α的mRNA及蛋白的表达情况,进一步研究了GSTD对小鼠HIRI的保护作用。
结果：首先在体外实验中发现,在H202诱导LSECs的氧化应激模型中,经GSTD预处理的LSECs中ROS和MDA的含量降低,提示GSTD能抑制H202诱导的氧化应激;TUNEL法、Annexin V-FITC-PI双染法检测发现GSTD处理后的细胞凋亡水平降低,提示GSTD对于H202诱导的细胞凋亡具有抑制作用;其次,研究提示GSTD抑制H202诱导的细胞凋亡和氧化应激反应是通过促进p38 MAPK的磷酸化从而激活Nrf2/HO-1通路实现的。GSTD处理后,p38 MAPK的磷酸化水平显著上升,并且高浓度的GSTD能够抵消p38MAPK抑制剂的作用。
同时GSTD能使Nrf2、HO-1的表达水平显著上调。利用shRNA敲低Nrf2的表达后,HO-1的表达随之降低,同时TUNEL阳性细胞的比例上升,ROS和MDA含量显著上升。核质分离及免疫共沉淀结果显示,GSTD在氧化应激刺激下调控Nrf2的主要途径是诱导Nrf2的核转位。小鼠体内实验结果显示,HIRI造成了肝脏氧化应激和炎症反应、肝脏细胞凋亡、坏死,而GSTD的预处理能够降低血清AST、ALT水平,减轻肝细胞坏死、凋亡、降低MDA水平,增加SOD活性,上调Nrf2和HO-1的表达,下调IL-6和TNF-α的表达,提示GSTD预处理在小鼠HIRI中发挥抗炎、抗氧化、抗凋亡作用。
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