嗜水气单胞菌分离株的鉴定与菌株肠毒素及致病性研究！
小杨 / 2024-04-17 09:26:16

 

嗜水气单胞菌(Aeromonas  hydrophila,以下简称Ah)广泛分布于污水、池水及河底土壤中,为革兰阴性杆菌,是引起腹泻的新病原菌。关于此菌的感染, 国外有较多报道, 而国内仅见有零星报道。近年来,我们对云南边防部队感染性腹泻进行病原监测,采集腹泻患者粪便标本328份,在分离多种肠道病原菌的同时,从中分离出5株Ah,该菌经镜检、培养、法国梅里埃VITEK32微生物全自动分析仪系统鉴定及电子显微镜下观察予以证实,并对菌株进行了肠毒素及致病性研究，报道如下。
　　
一、材料和方法
　　
1、菌株来源 
　　
从云南边防部队感染性腹泻患者粪便标本中分离。
　　
2、分离培养 
　　
将腹泻患者粪便标本接种于SS琼脂平板上置37℃孵箱培养18～24h，挑取可疑菌落进行纯培养。
　　
3、生化鉴定 
　　
采用常规法和法国梅里埃VITEK32全自动微生物分析仪NFC卡进行系统鉴定。
　　
4、电子显微镜检查 
　　
将分离菌接种普通肉汤培养基,37℃培养18h, 2%磷钨酸(PH6.4)负染制样,用日立－2型电镜检查。
　　
5、侵袭性测定 
　　
采用豚鼠角膜试验（Sereny  test）。
　　
6、肠毒素测定 
　　
采用乳鼠灌胃法测定热稳定性肠毒素(ST)。
　　
7、致病力测定 
　　
15～18g健康小白鼠（购自昆明医学院实验动物中心）雌雄兼用，随机分成试验组和对照组，每组5只，试验组注射Ah肉汤培养物，每只0.5ml,观察小白鼠发病情况，对照组同法注射无菌肉汤，观察7d。
　　
8、药敏试验 
　　
采用K-B纸片扩散法。药敏纸片系北京天坛生物技术开发公司产品，在有效期内使用。
　　
二、结果
　　
1、生物学特性 
　　
在SS琼脂平板上经37℃培养24h,其菌落形态为圆形，半透明、边缘整齐、光滑、湿润、微隆、直径1～2mm。菌体形态为革兰阴性杆菌，两端钝圆呈单或呈双排列。在暗视野下观察运动极为活泼，在电子显微镜下可见极端鞭毛（见图1）。
　　
2、系统生化鉴定
　　
VITEK32全自动微生物分析仪NFC卡系统鉴定结果见表1。表1 分离的嗜水气单胞菌生化特征试验项目结果 
　　
3、侵袭力测定 
　　
豚鼠角膜试验阴性。
　　
4、肠毒素测定 
　　
经乳鼠灌胃试验测试，分离的5株Ah肠/体之比均大于0.083,分别是0.091、0.105、0.087、0.123、0.096。证明产生较强的热稳定性肠毒素（ST）。
　　
5、致病力测定 
　　
5株分离菌肉汤培养物分别腹腔注射小白鼠后，均在24h左右发病，表现为弓背、耸毛、运动迟缓、食欲不振，双眼半闭、呼吸急促等症状，72h内相继死亡。解剖死亡的小白鼠，发现肠水肿，肠腔积液等，取肠内容物培养，仍获原感染菌。注射无菌肉汤的对照组观察7d无不良反应。
　　
6、药敏试验 
　　
在所试的12种抗菌药物中 ，对9种敏感，1种中度敏感，3种耐药，见表2。表2 分离的嗜水气单胞菌药敏试验结果抗菌素纸片含量（略）注：S: 敏感； MS: 中度敏感； R：耐药。
　　
三、讨论
　　
1、Ah是气单胞菌属中的细菌之一，该菌广泛存在于水环境中，是一种人—畜—水生动物共患病病原菌。此类菌致病性决定于某些菌株的侵袭力、热稳定性肠毒素和不稳定性肠毒素，该毒素和溶血素为气单胞菌类主要致病因子。该分离菌侵袭力测定为阴性，产热稳定性肠毒素（ST），致病性测定有较强的致病力，与临床症状密切相关。我们从边防部队腹泻病人粪便标本中分离出5株Ah，患者的主要临床表现是：类似急性胃肠炎，症见腹泻、呕吐、腹痛，无发热。Ah不仅感染动物，而且也是引起人类腹泻的新病原菌。由于条件所限，未做不稳定肠毒素和溶血素测试。目前，国外已将Ah纳入腹泻病原菌的检测范围。
　　
2、气单胞菌属的细菌通常不产生赖氨酸脱羧酶，但与致病性有关的气单胞菌赖氨酸脱羧酶阳性率较高，如本次分离的5株Ah赖氨酸脱羧酶均为阳性。对Ah的研究，国内很少有人用电子显微镜观察其菌体形态，我们使用了较先进的电镜对分离的Ah进行观察，有助于对菌体结构的认识。使用先进的VITEK32全自动微生物分析仪对其菌株进行鉴定，具有快速、省事、省力且结果准确等优点。由于Ah的生化特性与肠干菌科、弧菌属、邻单胞菌属较为相似，没有先进设备的基层单位，可利用氧化酶试验、粘丝试验、鸟氨酸脱羧酶和甘露醇、肌醇发酵等反应来鉴别。腹泻病原感染因子的研究在临床治疗上具有重要意义，不同细菌的感染因子所需的首选药物不尽相同，我们做的药敏试验，筛选出敏感、中度敏感、耐药三类药敏谱，对指导部队和地方今后治疗Ah的感染具有重要的指导意义。
 
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