NCI-H146人小细胞肺癌贴壁细胞系的应用！
小杨 / 2024-04-02 09:17:27
一、背景
NCI-H146人小细胞肺癌贴壁细胞系是一种常见的实验细胞系，被广泛应用于肿瘤研究，包括小细胞肺癌的研究。这种细胞系具有生长速度快、分裂旺盛、对癌基因突变易感等特点，因此被广泛用于肿瘤发生、发展、转移等方面的研究。
NCI-H146人小细胞肺癌贴壁细胞系的遗传背景比较清楚，具有多个基因突变，包括TP53、RB1等重要肿瘤抑制基因的突变。这种细胞系还具有某些与肿瘤转移相关的基因表达上调或下调的特点，因此被广泛用于探讨肿瘤转移的机制和寻找抗肿瘤药物的研究。
NCI-H146人小细胞肺癌贴壁细胞系是一种常用的肺癌细胞系，用于研究小细胞肺癌的发生、发展和治疗。该细胞系来源于一名患有小细胞肺癌的患者，经过多次传代和筛选，形成了具有贴壁生长特性的细胞株。
贴壁生长特性：该细胞系能够在含有血清的培养基中贴壁生长，形成单层或多层细胞。
高增殖率：该细胞系具有较高的增殖率，可以在短时间内获得大量的细胞。
多药耐药性：该细胞系具有多药耐药性，即对多种化疗药物具有抗性。
1)复苏NCI-H146人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)NCI-H146人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)NCI-H146人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
四、应用
探讨HOTTIP作为ceRNA诱导EMT参与小细胞肺癌发生发展及耐药机制的调节。通过本项目研究,进一步丰富小细胞肺癌发生及耐药的分子机制,为筛选小细胞肺癌耐药及预后的生物学标志物提供理论依据。
1、非编码RNA芯片课题组利用Arraystar公司的人类lncRNA芯片技术分析小细胞肺癌多药耐药细胞株(H69AR)、NCI-H146人小细胞肺癌贴壁细胞系与化疗敏感细胞株(H69)的lncRNA差异表达谱,并结合前期通过北京博奥生物芯片有限公司的miRNA芯片差异表达谱的结果,利用生物信息学技术寻找与小细胞肺癌耐药可能相关的非编码RNA分子。
2、临床样本收集2008年1月至2015年1月在南方医科大学附属顺德第一人民医院接受治疗的115例小细胞肺癌石蜡包埋组织,标本来自活检组织及纤维支气管镜检查穿刺组织,经病理诊断为小细胞肺癌。本研究经南方医科大学附属顺德第一人民医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。
3、细胞培养人小细胞肺癌化疗敏感细胞株NCI-H69、NCI-H446、NCI-H146人小细胞肺癌贴壁细胞系和多药耐药细胞株NCI-H69AR均购自美国ATCC;另一多药耐药细胞株H446DDP细胞为本课题组根据文献报道(PMID:2436751)的NCI-H69AR细胞的建立方法构建;16HBE为人支气管上皮细胞株。
4、细胞转染(1)瞬时转染:采用阳离子脂质体法,将miR-574-5p mimics(模拟物)、inhibitors(抑制物)或antagomir(拮抗剂,更稳定,可用于动物实验)及其阴性对照(miR-NC)序列,和HOTTIP、HOXA11、HOXA13、EZH1的小干扰RNA序列和pcDNA3.1/PEX-3表达载体及相应的阴性对照载体,分别转染5株小细胞肺癌细胞和1株人支气管上皮细胞,获得瞬时上下调miR-574-5p、HOTTIP、H0XA11、HOXA13、EZH1的细胞。操作按LipofectamineTM2000试剂说明书进行。(2)稳定转染:①采用阳离子脂质体法,将表达HOTTIP的pcDNA3.1载体及相应的空载体、表达HOXA11、HOXA13的PEX-3载体及PEX-2空载体(绿色荧光标记)分别转染H69和H446细胞,通过G418筛选阳性转染子进行扩大培养,获得稳定高表达HOTTIP、HOXA11、HOXA13的H69、NCI-H146人小细胞肺癌贴壁细胞系和H446细胞株。操作按LipofectamineTM2000试剂说明书进行。②采用慢病毒法,将HOTTIP的siRNA干扰序列通过LV3慢病毒载体包装后进行靶细胞侵染实验,同时设立LV3-NC对照转染组,获得稳定沉默HOTTIP的H146、H69AR及H446DDP细胞株。
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