小鼠B淋巴瘤细胞的知识与应用及培养操作！
小杨 / 2024-02-23 09:43:32
一、背景
WEHI-231，也被称为WEHI 231或WEHI231，是一种小鼠B淋巴瘤细胞系。这种细胞系源于BALB/c x NXB F1小鼠，通过矿物油注射诱导产生。
WEHI-231细胞在生物医学研究中具有广泛的应用，特别是在肿瘤学、免疫学、药物筛选和细胞治疗等领域。
首先，
WEHI-231（小鼠B淋巴瘤细胞）细胞系常被用作研究B细胞淋巴瘤的模型。由于其具有淋巴瘤的特性，这种细胞系可用于模拟人体B细胞淋巴瘤的发病过程，从而深入了解淋巴瘤的生物学特性、发病机制和治疗靶点。
其次，
WEHI-231（小鼠B淋巴瘤细胞）细胞也常被用于药物筛选和细胞治疗研究。由于其具有较高的增殖能力和对多种药物的敏感性，这种细胞系可用于测试新药物对淋巴瘤细胞的细胞毒性、抗增殖作用或诱导凋亡的能力。此外，WEHI-231细胞还可作为基因转染的宿主细胞，用于研究基因治疗对淋巴瘤的治疗效果。
1)复苏WEHI-231（小鼠B淋巴瘤细胞）细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)WEHI-231（小鼠B淋巴瘤细胞）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)WEHI-231（小鼠B淋巴瘤细胞）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
miR-29直接靶向PTEN影响PI3K/AKT通路调控B细胞AICD前面的实验,在转基因小鼠GS29来源的nave B细胞上证实了低表达miR-29能够促进B细胞的AICD。但原代B细胞体外难于存活,后续实验难于展开。故而先选用了公认的B细胞AICD体外模型,即体外以羊抗鼠anti-IgM刺激WEHI-231（小鼠B淋巴瘤细胞）细胞诱导AICD。转染microRNA-29a/b/c的mimics后WEHI-231（小鼠B淋巴瘤细胞）细胞的AICD明显降低,而转染inhibitor后WEHI-231细胞的AICD明显增强。这些实验再次证明了miR-29能够有效调控B细胞的AICD。
对targetscan网站提供的miR-29的1000多个靶点进行GO分析,发现这些靶点中有85个靶点涉及细胞存活与生长发育。再对这85个基因,进行keggpathway富集分析,选取选取couts比较高的四个pathway进行vanny分析,筛选出两个具有广泛作用的两个分子:PTEN与PIK3CA。而后,我们构建了PTEN、PIK3CA以及它们突变体的报告基因用于双荧光报告基因实验,验证靶点。
结果显示,miR-29能够直接靶向PTEN,抑制PTEN 3’UTR报告基因的活性。而对于PIK3CA的靶点验证未能得到证实。后续我们构建了PTEN的质粒和siRNA,分别进行过表达和干扰实验,进一步验证miR-29可通过PTEN调控WEHI-231（小鼠B淋巴瘤细胞）细胞的AICD。PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)基因一方面是个明星抑癌基因,另一方面其带有双重特异性磷酸酶,能够使PIP3(phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate,PIP3)脱磷酸化,最终抑制PI3K/AKT通路。而B细胞的AICD主要涉及三种信号,PLCγ,Ras和PI3K/AKT。故而,我们western蛋白印迹法检测了antagomir-29a-3p处理的WEHI-231细胞中p-AKT水平,发现p-AKT水平明显低于对照组。这一实验证实mir-29通过靶向PTEN影响PI3K/AKT通路。进一步研究,我们发现p-BAD水平明显降低;抗凋亡分子Bcl-2和Bcl-xl水平亦降低。以上结果显示,mir-29通过靶向PTEN抑制PI3K/AKT信号通路,导致AKT磷酸化水平降低,影响下游抗凋亡分子Bcl-2和Bcl-xl的表达,最终增强B细胞的AICD。
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