犬流感病毒通用PCR试剂盒的应用及研究动态！
小杨 / 2024-01-22 08:45:48
一、背景
犬流感病毒通用PCR试剂盒是一种用于检测犬流感病毒的实验工具，采用聚合酶链式反应（PCR）技术进行检测。该试剂盒具有高灵敏度和特异性，能够快速、准确地检测出犬流感病毒，对于该病的诊断和治疗具有重要意义。
犬流感病毒是一种常见的病毒，可引起犬类呼吸道感染。该病毒可以通过直接接触感染犬或接触污染的环境进行传播。感染犬流感病毒的犬可能会出现咳嗽、流鼻涕、高热等症状，严重时可能导致肺炎和死亡。因此，对犬流感病毒进行快速、准确的检测对于控制该病的传播和预防具有重要意义。
犬流感病毒通用PCR试剂盒的组成通常包括一对引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs等必要的PCR反应成分，以及可能包含的各种成分如染料、缓冲液、特异性结合探针等。引物是PCR反应的关键成分，它们与犬流感病毒基因的特定区域结合，从而启动DNA的扩增过程。Taq DNA聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，能够催化DNA的合成。dNTPs是合成DNA的基本原料。
使用犬流感病毒通用PCR试剂盒进行检测时，首先需要采集感染犬流感病毒的样本，如鼻拭子或咽拭子等。将样本中的DNA或RNA与试剂盒中的引物和Taq DNA聚合酶等成分混合，进行PCR反应。反应过程中，DNA或RNA会不断扩增，最终形成大量的特定基因片段。通过凝胶电泳等技术对这些片段进行分析，可以判断出是否存在犬流感病毒基因，从而确定犬是否感染该病原体。
1、样本采集：从患者体内采集血液、粪便、组织等样本，并将其保存在无菌容器中。
2、DNA提取：将采集到的样本进行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取试剂盒。提取后的DNA应保存在-20°C或更低的温度下。
3、PCR反应体系准备：根据犬流感病毒通用PCR试剂盒的要求，配制PCR反应体系，包括引物、荧光探针、dNTPs、DNA聚合酶等。
4、PCR反应：将提取的DNA加入到PCR反应体系中，进行PCR反应。反应条件和时间根据试剂盒说明书的要求进行设置。
5、结果分析：将PCR反应后的产物进行荧光信号检测，根据荧光信号的出现情况判断是否存在犬流感病毒的感染。
三、应用
以流感病毒高度保守的M1蛋白为靶标,通过噬菌体抗体库筛选特异性抗M1蛋白的scFv,并对scFv进行免疫结合活性和生物学活性研究;然后将利用具有高效跨膜转导功能的TAT蛋白构建TAT-scFv穿梭胞内抗体,在细胞水平和SPF鸡胚中评价胞内抗体对A/Canine/Guangdong/05/2011(H3N2)、A/Duck/Guangdong/W12/2011(H3N2)和A/Beijing/1/1968(H3N2)三株异源流感病毒增殖的影响。
1、H3N2犬流感病毒M1蛋白的原核表达及鉴定为制备犬流感病毒(H3N2)M1蛋白纯品,针对H3N2犬流感病毒M1蛋白高度保守序列设计引物,犬流感病毒通用PCR试剂盒PCR扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,Western blot检测纯化的M1蛋白。通过犬流感病毒通用PCR试剂盒PCR成功扩增出大小为771bp的M1基因,成功构建pET-SUMO-M1表达质粒,经酶切纯化后获得M1蛋白纯品,为进一步制备通用型抗H3N2犬流感病毒抗体提供纯品抗原。
2、抗H3N2犬流感病毒M1蛋白scFv的筛选及活性研究以M1为靶蛋白,采用固定相筛选法同时从噬菌体抗体库Tomlinson I库(库容量:1.47×108)和Tomlinson J库(库容量:1.37×108)中筛选抗M1蛋白的单链抗体,进行四轮生物淘洗后,显示每增加一轮筛选高亲和力阳性噬菌体克隆富集倍数都有所提高。通过间接ELISA法和犬流感病毒通用PCR试剂盒PCR鉴定筛选阳性菌株,最终获得C2菌株与M1靶蛋白的免疫结合活性最显著,对C2菌株抗体基因进行分析,具有完整的单链抗体结构。C2菌株扩大培养并成功纯化出H3N2-scFv纯品,BCA检测蛋白浓度为1.6mg/mL,薄层扫描显示纯度为98.9%,利用WB法对纯化的scFv进行鉴定,结果显示制备的scFv和M1靶蛋白具有良好的免疫结合活性。在细胞水平和SPF鸡胚模型中生物学活性研究显示,scFv在浓度高达1.6mg/mL对细胞和鸡胚没有显著的毒性作用,对A/Canine/Guangdong/05/2011(H3N2)株犬流感病毒复制具有显著的抑制作用,呈现剂量依赖性特征,细胞水平IC50=0.290mg/mL,鸡胚水平IC50=0.120mg/mL,证明在鸡胚中,scFv的灵敏度更高。
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