小鼠睾丸间质细胞的背景与应用及培养操作步骤！
小杨 / 2024-01-02 09:39:52
一、背景
小鼠睾丸间质细胞是睾丸中的一种支持细胞，位于生精小管之间。它们的主要功能是提供营养物质和支持生殖细胞的发育和成熟。
小鼠睾丸间质细胞在小鼠睾丸中占据了大约40%的体积，并通过其长长的突起与生精小管相连。它们通过分泌多种生长因子、激素和其他物质来调节生精小管内生殖细胞的发育和成熟。
维持生精小管的结构：Sertoli细胞通过分泌胶原蛋白和其他基质分子来维持生精小管的结构和稳定性。
支持精子的发育和成熟：Sertoli细胞通过分泌多种营养物质和激素来支持精子的发育和成熟。
保护生殖细胞：Sertoli细胞可以分泌一些抗炎和抗氧化物质来保护生殖细胞免受氧化应激和其他有害因素的损伤。
1)复苏小鼠睾丸间质细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)小鼠睾丸间质细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)小鼠睾丸间质细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
小鼠睾丸间质细胞可以用于线粒体分裂及自噬在镉致小鼠睾丸间质细胞凋亡中的作用机制：
以镉为受试物,选择雄性小鼠、原代小鼠睾丸间质细胞和睾丸间质细胞系TM3细胞作为研究对象,探讨镉是否通过调控线粒体的融合与分裂以及线粒体自噬等途径诱导睾丸间质细胞凋亡,为全面了解镉的男性生殖毒性机制提供新的证据。
镉诱导雄性小鼠睾丸间质细胞凋亡与自噬抑制的研究目的:在动物水平探讨氯化镉(Cadmium chloride,CdCl2)处理对小鼠睾丸间质细胞毒性的潜在机制。
方法：根据随机数值表将20只4周龄雄性C57BL/6小鼠随机分成四组,每组5只,分别以0、0.5、1.0和2.0 mg/kg/day浓度的CdCl2连续28天暴露,构建染镉动物模型。通过HE染色、精子计数和精子畸形率检测评估镉暴露后睾丸毒性。采用ELISA法、免疫组织化学法分别测定镉暴露后血清睾酮含量以及小鼠睾丸间质细胞数量。采用免疫荧光结合TUNEL染色分析小鼠睾丸中睾丸间质细胞的凋亡情况。使用透射电子显微镜和免疫荧光分别观察小鼠睾丸间质细胞内自噬体和LC3的变化。
结果：镉暴露后,2.0 mg/kg镉处理组小鼠体重从第二周开始下降(P<0.05),而0.5和1.0mg/kg镉处理组中小鼠体重则从第三周开始下降(P<0.05),在4周暴露结束时,所有镉处理组小鼠体重均较对照组下降。但睾丸/体重比值无显著变化,精子数量降低且精子畸形率升高(P<0.05)。与对照组相比,镉处理组小鼠的血清睾酮含量降低,生精小管结构异常,精子细胞排列紊乱;睾丸间质细胞数量减少且细胞凋亡率随着染镉剂量的升高而增加(P<0.05)。透射显微镜显示,与对照组相比,镉处理组小鼠睾丸间质细胞内有较多的自噬泡、自噬体并伴随着极少量的自噬溶酶体形成。对睾丸组织的免疫荧光检测显示,镉处理组自噬关键蛋白LC3在睾丸间质细胞中表达,且随着染镉剂量的升高而表达增加。
结论：镉暴露破坏了小鼠睾丸组织结构,导致精子数量减少、精子畸形率增加、睾酮含量降低,产生生殖毒性。同时,镉暴露诱导睾丸间质细胞发生凋亡以及调节睾丸间质细胞内的自噬水平。镉诱导线粒体过度分裂致小鼠睾丸间质细胞凋亡的机制目的:第一部分的研究结果表明,在动物水平镉诱导了小鼠睾丸间质细胞凋亡。以TM3细胞(小鼠睾丸间质细胞的模式细胞系)为研究对象,通过观察线粒体形态变化、线粒体分裂和融合蛋白表达、线粒体功能以及线粒体依赖性凋亡相关蛋白表达等指标,探讨镉暴露对TM3细胞凋亡的影响及可能的机制。
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