一、背景
人肾癌WILMS细胞来源于一名3个月大的婴儿的肾Wilms瘤，由于该类肿瘤分类的改变，经Garvin等鉴定后发现该细胞来源于肾横纹肌样瘤；G-401细胞分泌肾母细胞生长因子(NB-GF)。
二、人肾癌WILMS细胞培养步骤
1、培养基及培养冻存条件准备：
1）准备人肾癌WILMS细胞基础培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。
2）人肾癌WILMS细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）人肾癌WILMS细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
2、人肾癌WILMS细胞处理：
1）复苏人肾癌WILMS细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）人肾癌WILMS细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）人肾癌WILMS细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。
三、应用
人肾癌WILMS细胞可以用于吴茱萸碱诱导人肾癌细胞凋亡的分子机制研究：
吴茱萸碱(Evodiamine,EVO)是一种从吴茱萸(Evodia rutaecarpa)果实中分离得到的吲哚喹唑啉类生物碱。数千年来,它被认为是一种有效的中药,可用于治疗胃病,高血压和湿疹。在过去的十年中,越来越多的证据表明EVO可以表现出各种生物活性,包括抗菌、减肥和抗真菌活性。最近,已经确定EVO对胃腺癌、结肠(lovo细胞系)、结肠直肠癌和乳腺癌细胞具有抗肿瘤活性。
先前的研究表明EVO可以抑制癌细胞的增殖,侵袭和转移,然而针对癌细胞的作用机制仍有待阐明,并且尚未报道EVO在体外人肾癌中的功能研究。在本研究中,进行了细胞学实验和转录组分析研究,揭示了EVO的抗癌机制。
首先,在EVO处理下进行一系列人肾癌786-0细胞和Caki-1细胞和人肾上皮细胞系HK-2细胞活力和增殖的实验。然后,使用转录组分析研究来分析有关生长和凋亡的EVO-调节的基因和信号传导途径。此外,使用超微结构观察,流式细胞术和qPCR验证了EVO抑制生长和诱导细胞凋亡的分子机制。
我们发现EVO在体外不仅可以改变肾癌细胞形态并以时间和剂量依赖性方式抑制细胞的活力和增殖能力。另外,转录组分析表明EVO可以调节Caki-1细胞系的转录组。
共发现差异表达基因7243个,其中下调基因3347个,上调基因3896个,主要涉及细胞迁移、凋亡、细胞周期和DNA复制等。此外,我们证明EVO可以诱导细胞凋亡,使细胞停滞在G2/M期并且调节Caki-1细胞中细胞凋亡和细胞周期相关基因的基因表达。
研究通过细胞生物学和分子生物学探究EVO的抗肾癌作用,并表明EVO作为一种潜在的资源有望应用到肾癌治疗中。
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