一、背景
人骨髓间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSCs可以在体内或体外特定的诱导条件下，分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。
二、人骨髓间充质干细胞培养步骤
1、人骨髓间充质干细胞培养基及培养冻存条件准备：
1）准备人骨髓间充质干细胞培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。
2）人骨髓间充质干细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）人骨髓间充质干细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
2、细胞处理：
1）复苏人骨髓间充质干细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）人骨髓间充质干细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁人骨髓间充质干细胞，传代可参考以下方法：
1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4、将人骨髓间充质干细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）人骨髓间充质干细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。
三、应用
人骨髓间充质干细胞可以用于miR-155-5p调控Sort1参与人骨髓间充质干细胞成脂分化：
成人骨髓间充质干细胞(human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs)定向分化为成骨细胞和脂肪细胞的比例失衡(成骨细胞减少、脂肪细胞增多),将导致骨量下降,是骨质疏松发生发展的关键因素。因此,hMSCs的成脂分化调控机制是骨质疏松研究的重要基础理论问题之一。Micro RNAs是近年来证实的影响成脂分化的重要调节因子,其中miR-155在hMSCs定向分化中发挥调控作用,但其在成脂分化机制尚不清楚,明确miR-155-5p调控Sort1参与人骨髓间充质干细胞成脂分化机制,为骨质疏松症、肥胖等临床相关疾病的防治提供理论依据。
方法：
1、hMSCs细胞周期和表面标记的检测hMSCs纯化传代培养,流式细胞术分析细胞周期,同时用流式细胞术检测hMSCs表面标记:CD14、CD34、CD45、HLA-DR;CD29、CD44、CD90、CD105;Moμse Ig2a、Moμse Ig1阴性对照。
2、正常成脂诱导,hMSCs成脂效率评价第六代hMSCs细胞给予成脂分化诱导液诱导7天,14天,油红O染色后观察脂滴形成情况;qRT-PCR分析Ap2、PPARγ、CEBPα等成脂标志性基因的表达,Western blot检测蛋白表达水平。
3、miR-155-5p的表达检测miR-155-5p在hMSCs细胞给予成脂分化诱导液诱导7天、14天脂肪形成过程中,采用qRT-PCR分析miR-155-5p的表达。
4、过表达miR-155-5p后,hMSCs成脂效率评价转染过表达miR-155-5p慢病毒后,荧光显微镜下观察细胞形态及转染效率。转染后,进行细胞成脂诱导,在不同时间节点收集细胞,油红O进行染色,观察结果,异丙醇洗脱后,酶标仪490nm测量OD值,以定量细胞内脂滴积累情况;采用qRT-PCR技术检测基因表达情况,Western blot检测蛋白表达水平。
5、miR-155-5p及其靶基因的筛选和验证针对hMSCs成脂分化过程,运用Illumina Hi Seq X ten平台实施Small RNA动态测序,关联m RNA-seq(转录组测序)结果,联合分析miRNA及m RNA的表达趋势,聚类分析差异表达miRNA与m RNA,再结合靶基因预测数据库(Target Scan、miRanda和Pic Tar)预测miRNA潜在靶基因,聚焦miR-155-5p及潜在靶基因Sort1。qRT-PCR、Western blot检测Sort1在hMSCs成脂分化过程中基因表达及蛋白水平;采用双荧光素酶技术验证miR-155-5p靶向作用Sort1基因。
6、Sort1基因表达和蛋白水平检测过表达miR-155-5p后,细胞给予成脂分化诱导液诱导7天,14天,qRT-PCR技术检测靶基因Sort1的表达水平,Western blot检测蛋白表达。
结果：
1、检测结果显示细胞周期:S+G2/M期细胞15%,G0/G1期的细胞85%。hMSCs表面标记:CD14、CD34、CD45、HLA-DR(阴性结果);CD29、CD44、CD90、CD105(阳性结果);Moμse Ig2a、Moμse Ig1阴性对照。hMSCs同时满足细胞周期和表面标记的要求。
2、正常成脂诱导,油红O染色结果显示脂滴明显增多,qRT-PCR检测结果显示成脂标志基因表达明显逐渐升高,成脂效率高。
3、hMSCs成脂分化过程中,qRT-PCR检测结果显示miR-155-5p表达呈明显逐渐下降趋势。
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