一、背景
CAL27细胞系人舌鳞状癌细胞该细胞1982年由J.Gioanni建系，源自一位56岁白人男性的舌头中倍的病变部位，角蛋白强阳性。
二、CAL27细胞系人舌鳞状癌细胞培养步骤
1）复苏CAL27细胞系人舌鳞状癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mLCAL27细胞系人舌鳞状癌细胞培养基后吹匀。然后将所有CAL27细胞系人舌鳞状癌细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）CAL27细胞系人舌鳞状癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁CAL27细胞系人舌鳞状癌细胞，传代可参考以下方法：
1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的CAL27细胞系人舌鳞状癌细胞培养基终止消化。
3、轻轻吹打CAL27细胞系人舌鳞状癌细胞，CAL27细胞系人舌鳞状癌细胞脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4、按5-6ml/瓶补加培养液，将CAL27细胞系人舌鳞状癌细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
3）CAL27细胞系人舌鳞状癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，CAL27细胞系人舌鳞状癌细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。
三、应用
CAL27细胞系人舌鳞状癌细胞可以用于YAP基因对口腔鳞癌细胞系CAL27增殖凋亡的影响及机制研究：
探讨YAP对口腔鳞癌细胞CAL27的增殖和凋亡的影响,并研究其在体内体外促肿瘤的作用和机制,为YAP基因作为口腔鳞癌治疗新的靶点提供理论依据。
实验方法：
1、用免疫组化法检测不同分化程度的口腔鳞癌和正常口腔上皮组织中YAP蛋白的表达情况。
2、检测YAP在4株口腔鳞状细胞癌细胞系中的表达水平,并选择CAL27作为进一步的实验材料。利用慢病毒载体转染CAL27细胞,分别构建敲除和过表达YAP基因及对照组的口腔鳞癌细胞系。通过QRT-PCR及Western blot检测敲除和过表达效率。
3、利用CCK-8细胞活力实验,EdU染色法,克隆形成实验来检测敲除和过表达YAP对CAL27细胞增殖的影响;流式细胞术检测YAP对细胞周期和细胞凋亡的影响。通过QRT-PCR及Western blot技术检测C-MYC、BCL-2等周期和凋亡相关因子随YAP表达改变时的情况。
4、以不同浓度的Hippo-YAP信号通路抑制剂维替泊芬处理CAL27细胞,利用CCK-8细胞活力实验、流式细胞术来检测细胞增殖、凋亡和周期的改变;利用QRT-PCR及Western blot技术检测C-MYC和BCL-2等因子随抑制剂浓度改变情况。
5、利用裸鼠成瘤实验,将敲除组、过表达组及相应对照组CAL27细胞注入到裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况,分析YAP的不同表达水平对口腔鳞癌发生发展的影响。
实验结果：
1、YAP蛋白在正常口腔上皮组织中基本不表达,或表达较弱;口腔鳞状细胞癌中,YAP蛋白的表达水平较高,与肿瘤分化程度有关。
2、在CAL27细胞中,YAP基因和蛋白表达水平适中。在敲除YAP基因后,YAP及其下游靶基因CTGF、ANKRD、CYR61表达水平明显降低,同时细胞中总YAP和细胞核中YAP表达水平均降低。过表达YAP基因后,YAP及其下游靶基因CTGF、ANKRD、CYR61表达水平明显升高,而细胞中总YAP和胞核中YAP表达水平均升高。
3、与对照组相比,敲除YAP基因后,CAL27细胞增殖较慢,细胞周期阻滞,同时早期凋亡和晚期凋亡细胞比例均升高;C-MYC和BCL-2mRNA及蛋白表达水平均降低;周期相关蛋白CyclinD1表达水平下降,促凋亡蛋白BAX、Caspase7表达水平升高。过表达YAP基因后,CAL27细胞增殖加快,细胞周期进展加速,早、晚期凋亡细胞比例均降低;C-MYC和BCL-2表达水平升高;CyclinD1蛋白表达水平升高,BAX、Caspase7蛋白表达水平下降。
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