一、背景
SK-HEP-1细胞已被鉴定为内皮来源。SK-HEP-1细胞为异倍体女性人(XX)，染色体在亚三倍体范围内。在裸鼠中，SK-HEP-1细胞能形成与肝癌相一致的大细胞癌。
二、SK-HEP-1细胞培养操作
1)复苏SK-HEP-1细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)SK-HEP-1细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-2 min（视细胞情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2-3ml完全培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
c、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)SK-HEP-1细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
SK-HEP-1可以用于松花粉诱导人肝癌细胞株SK-Hep-1细胞增殖、凋亡和自噬及其机制研究：
通过观察松花粉对人肝癌细胞株SK-Hep-1细胞增殖、凋亡、细胞周期和自噬的影响,进一步探讨松花粉抗肝癌作用及其机制,为松花粉的临床应用提供理论和实验依据。
方法：体外培养人肝癌SK-Hep-1细胞,随机分为4组,分别为对照组(0 mg/m L松花粉)、实验组(30、45、60 mg/m L松花粉)。
(1)采用细胞增殖/毒性检测试剂盒CCK-8,检测不同浓度松花粉干预不同时间(12、24、48和72 h)后的SK-Hep-1细胞抑制率;
(2)松花粉作用2 w后,平板克隆实验观察松花粉对SK-Hep-1细胞克隆、增殖的影响;
(3)松花粉处理48 h后,倒置相差显微镜观察松花粉干预后的SK-Hep-1细胞形态学变化;
(4)Hoechst 33258荧光染色法检测细胞凋亡的形态学变化和Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞术观察细胞凋亡的情况;
(5)流式细胞仪检测SK-Hep-1细胞的细胞周期变化;
(6)RT-PCR方法检测自噬相关基因Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62 m RNA的表达水平,Western blot法检测自噬相关基因Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62的蛋白表达水平;
(7)数据处理采用SPSS 23.0统计软件,计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示,多组间比较采用one-way ANOVA或非参数检验进行比较,以P<0.05表示差异有统计学意义。
结果：
(1)CCK-8法检测显示,松花粉能明显抑制SK-Hep-1细胞增殖,并具有时间和剂量依赖性;
(2)平板克隆实验显示,随着松花粉浓度的增高,细胞形成集落数量减少;
(3)倒置相差显微镜显示,松花粉可以抑制细胞的增殖;
(4)Hoechst 33258荧光染色显示,松花粉可以促进细胞凋亡;Annexin V-FITC/PI双染法显示,与对照组比较,松花粉不同浓度组干预后细胞凋亡率明显升高(P<0.05或P<0.01),并且细胞凋亡率随着药物作用浓度的增高而增加;
(5)细胞周期实验显示,松花粉能使SK-Hep-1细胞周期阻滞于G1期,同时S期和G2期的细胞比例也下降;
(6)RT-PCR分析显示,经松花粉(30、45、60 mg/m L)处理后,Beclin-1、LC3-Ⅱ的m RNA表达较对照组明显增加(P<0.05或P<0.01),而P62的m RNA表达较对照组降低(P<0.05或P<0.01);Western blot法检测自噬相关基因蛋白的表达水平,也同样得出相同的结论。这进一步证明了松花粉对人肝癌SK-Hep-1细胞具有促进自噬的作用。
结论：
(1)松花粉能明显降低人肝癌SK-Hep-1细胞增殖能力,且呈剂量和时间依赖性;松花粉能促进细胞的凋亡并使细胞阻滞于细胞周期G1期。
(2)松花粉可使人肝癌SK-Hep-1细胞中自噬增强,促进人肝癌细胞株SK-Hep-1细胞的自噬作用,其机制可能是通过提高人肝癌SK-Hep-1细胞Beclin-1、LC3-Ⅱ表达,降低SK-Hep-1细胞P62表达,通过诱导自噬从而发挥抗肝癌的作用。
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