一、背景
人卵巢癌细胞是从一名47岁的黑人妇女的外科肿瘤标本中建立的。该肿瘤被描述为低分化卵巢透明细胞癌。最初，细胞生长在软琼脂中。在裸鼠中成瘤。该细胞对多种化疗药物包括doxorubicin,cisplatin,carmustine,etoposide和cyanomorpholinodoxorubicin(MRA-CN)表现出低到中等的耐受性。ES-2细胞表达低水平的P糖蛋白。
二、人卵巢癌细胞培养步骤
1）复苏人卵巢癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL人卵巢癌细胞培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）人卵巢癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于人卵巢癌细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的*培养基终止消化。
3.轻轻吹打人卵巢癌细胞，脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
3）人卵巢癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。
三、应用
人卵巢癌细胞可以用于E3泛素连接酶UBR5在卵巢癌细胞ES-2中的功能初探；
卵巢透明细胞癌是上皮性卵巢癌的一种,属于恶性肿瘤,早期所占比例较大,5年的生存率较高,但是一旦发展到晚期,相比于卵巢癌其他类型生存率更低。临床上的治疗方案基本是参考卵巢浆液性癌。
了解卵巢癌发病机制,能够更好地预测和筛查风险人群,同时识别潜在的病因有助于降低卵巢癌发病率。UBR5(Ubiquitin protein ligase E3component n-recognin 5,UBR5)是一种E3泛素连接酶,最初作为肿瘤抑制因子在乳腺癌细胞中被发现,参与泛素化过程及DNA损伤、细胞增殖、细胞代谢、细胞迁移侵袭与凋亡等多种重要的生物学过程。
有研究显示,UBR5在卵巢癌中高表达,有研究人员建议将其作为卵巢癌患者预后不良的指标,但UBR5在卵巢癌中的功能与作用机制尚不清楚。
因此,本研究通过细胞生物学、生物信息学等方法探究UBR5在卵巢癌细胞系ES-2中的功能及可能的作用机制。对Ualcan数据库中不同癌症中UBR5表达情况分析结果显示,UBR5在肺腺癌、胆管癌、食道癌、胃癌、结肠腺癌、直肠癌等患者的癌症组织中均高表达。
对来自Expression Atlas数据库以及癌细胞系百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedia,CCLE)中的7种人类卵巢癌细胞系的RNA-seq数据进行筛选分析,结果发现UBR5在卵巢癌细胞系ES-2中高表达。
本实验通过Western blot和RT-q PCR发现与正常上皮细胞IOSE80相比,UBR5在ES-2细胞中高表达,因此,我们选择卵巢癌细胞ES-2作为实验材料,利用CRISPR-Cas9与sh RNA技术对UBR5进行敲除与敲低,以探究UBR5在卵巢癌细胞ES-2中的功能及可能机制。
结果显示,敲除与敲低UBR5后,ES-2细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移与侵袭能力减弱,细胞周期阻滞于S和G2/M期,细胞凋亡增加。转录组测序结果显示,敲低UBR5后有7697个基因的表达水平发生显著变化,这些差异表达基因主要富集于细胞生长、细胞黏附等生物过程,细胞外基质、细胞骨架等细胞组分及细胞表面受体信号通路、信号转导调节等生物功能。这些结果显示,UBR5与ES-2细胞的增殖、迁移、侵袭、细胞周期调控以及凋亡有关。
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