一、背景
人整合SV40基因的乳腺上皮细胞由E.V.Gaffney及其同事从一位没有乳癌家族史的供者乳汁中建立，培养出来的细胞染色体组型在第7代时就不正常；电镜照片显示有微丝、张力原纤维和桥粒；Southern转移表明有整合型SV40病毒基因，不可以当作正常细胞。
二、人整合SV40基因的乳腺上皮细胞培养基及培养冻存条件准备
1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
三、人整合SV40基因的乳腺上皮细胞处理
1）冻存人整合SV40基因的乳腺上皮细胞的复苏：
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2）人整合SV40基因的乳腺上皮细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁人整合SV40基因的乳腺上皮细胞传代可以参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3）人整合SV40基因的乳腺上皮细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
四、应用
人整合SV40基因的乳腺上皮细胞可以用于BMP9通过下调CTGF抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231骨转移：
研究BMP9对乳腺癌细胞骨转移的作用及其分子机制。
方法：RT-PCR检测临床乳腺癌及其癌旁组织,以及转移能力不同的几株乳腺癌细胞系中BMP9的表达;以人乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象,扩增高滴度的BMP9表达腺病毒,感染该细胞,制备高表达BMP9的重组MDA-MB-231/BMP9细胞,以此作为实验组;同时以含GFP的空载腺病毒感染该细胞制备MDA-MB-231/GFP,联合空白MDA-MB-231共同作为对照组;通过平板集落形成实验、细胞划痕实验﹑Transwell侵袭实验检测重组MDA-MB-231/BMP9细胞侵袭及迁移能力。
Real Time PCR检测肿瘤骨转移相关基因CTGF、ID1、CXCR4在MDA-MB-231/BMP9中的表达;制备CTGF条件培养基刺激MDA-MB-231/BMP9,通过细胞划痕实验﹑Transwell侵袭实验检测在外源性CTGF蛋白的条件下重组MDA-MB-231/BMP9细胞的侵袭及迁移能力改变。
在裸鼠胫骨骨膜下分别注射上述乳腺癌细胞,制备乳腺癌骨转移模型,观察BMP9是否能抑制乳腺癌细胞的骨转移,免疫组化分析CTGF在转移骨内的表达改变情况;通过BMP9、CTGF两种腺病毒共感染MDA-MB-231细胞,制备高表达BMP9和CTGF的重组MDA-MB-231/BMP9/CTGF细胞,以此作为实验组,同时以MDA-MB-231/BMP9/RFP作为对照组,观察在CTGF存在的情况下,两组细胞所致裸鼠长骨溶骨性损伤的差异。
结果：在6对临床乳腺癌及癌旁组织中,BMP9在其中5例癌组织中表达缺失,而在相应癌旁组织中有较高表达,1例在癌组织和癌旁组织均有表达,但癌旁组织中BMP9表达明显高于癌组织;在转移能力不同的乳腺癌细胞系中,高转移能力的MDA-MB-231中表达缺失,转移能力低的MCF7和整合SV40的乳腺上皮细胞HBL-100中BMP9有较高表达。
选择MDA-MB-231细胞作为研究对象,通过体外BMP9腺病毒感染制备高表达BMP9的MDA-MB-231/BMP9重组细胞作为实验组。与对照组细胞相比,实验组细胞中BMP9 mRNA表达水平明显增高;集落形成率由对照的(90.6±2.5)%与(85.6±3.5)%显著下降至(57.3±4.5)%(P<0.05);划痕愈合率由对照的(95.4±3.1)%与(92.5±2.4)%下降至(74.0±3.6)%(P<0.05);Transwell实验中穿膜细胞数由对照的(255.3±16.1)个与(267.3±14.9)个下降至(150.3±14.6)个(P<0.05);定量PCR结果显示MDA-MB-231/BMP9细胞中肿瘤骨转移相关基因CTGF表达下调。
通过CTGF条件培养基刺激MDA-MB-231/BMP9细胞,在外源性CTGF蛋白存在的条件下,划痕实验结果显示实验组MDA-MB-231/BMP9+CTGF细胞划痕愈合率由对照组MDA-MB-231/BMP9+GFP组的(32.2±1.6)%上升至(85.3±3.1)%(P<0.05),Transwell实验中穿膜细胞数由对照MDA-MB-231/BMP9+GFP穿膜细胞数(135.8±10.1)个上升至(248.5±21.6)个(P<0.05)。
裸鼠胫骨分别注射实验组与对照组细胞,制备乳腺癌骨转移模型,发现BMP9能显著抑制乳腺癌MDA-MB-231溶骨性转移,免疫组化结果显示CTGF在MDA-MB-231/BMP9所致的转移骨组织中表达下调(P<0.05),恢复CTGF表达后MDA-MB-231/BMP9/CTGF的溶骨性区域明显大于MDA-MB-231/BMP9/RFP组。
北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！