磷酸钙法细胞转染试剂盒的应用！
小杨 / 2020-09-18 08:45:07
一、背景
磷酸钙法细胞转染试剂盒用于磷酸钙法转染细胞,适合于大多数贴壁细胞的转染。磷酸钙法细胞转染试剂盒在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性。用磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。
磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法，磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。
磷酸钙转染技术是由Graham等于1973年首创，实验室中转染哺乳动物细胞最广泛使用的方法。尽管磷酸钙转染是一种简单的基因治疗方法，但由于受沉淀条件(比如pH值、温度、盐和DNA的浓度以及沉淀与转染的时间控制等)影响很大，并且磷酸钙易失活，因此这个过程很难标准化。
磷酸钙转染法的原理是通过DNA，氯化钙与磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA的极小不溶解的磷酸钙颗粒。这些磷酸钙颗粒会粘结到细胞膜上通过胞饮作用进入细胞中，从而达到外源质粒转染进入细胞的目的。磷酸钙转染法主要用于慢病毒包装。由于慢病毒包装需要的质粒量大，脂质体用量大，可能会影响细胞状态。而磷酸钙沉淀法因为试剂易取得、价格便宜而被广泛应用。
二、应用
用于改性蒙脱土细胞毒性、凋亡研究与改性磷酸钙转染载体研究：
运用细胞活性减低作用实验,LDH释放检测,凋亡程度检测,caspase-3酶活性检测,凋亡相关基因的转录活性检测,以及相关基因蛋白水平和mRNA水平检测来衡量PSAN-MMT。
无毒的MMT被用来跟PSAN-MMT作对照。PSAN-MMT和MMT都以剂量依赖的方式减低细胞活性并且增加LDH的释放,这种效果在浓度为1 g／L时在明显,但PSAN-MMT的效果要明显比MMT低。同样以1 g／L的浓度处理细胞检测其凋亡程度,PSAN-MMT处理的细胞凋亡程度依然比MMT处理的细胞低,对其进行caspase-3酶活性检测,结果依然符合前面的结果。
发现高浓度的PSAN-MMT和MMT都能提高p53的转录活性,MMT提高p53转录活性的程度要比PSAN-MMT高,PSAN-MMT和MMT也能上调p53的蛋白表达水平和p53、p21的mRNA水平,程度也是PSAN-MMT比MMT低。本研究发现PSAN-MMT与MMT一样,是没有细胞毒性的,并推测高浓度下PSAN-MMT和MMT引起的凋亡机理是激活了一些前凋亡基因比如p53和p21。可以认为寡聚苯乙烯氰乙烯改性蒙脱土可以安全的作为可控大分子药物和基因治疗药物载体使用。
鱼精蛋白改性磷酸钙转染载体研究为研究鱼精蛋白改性是否能提高磷酸钙转染效果并对磷酸钙颗粒产生怎样的影响,使用pEGFP-N1绿色荧光质粒作指示,转染细胞研究其转染效率变化,使用原子力显微镜检测磷酸钙颗粒的形态变化和粒径大小,并使用MTT法检测鱼精蛋白改性后磷酸钙颗粒对细胞的活性抑制作用。
共沉淀法合成的磷酸钙被用来跟鱼精蛋白改性磷酸钙做对照。在293 FT、HEK 293和NIH 3T3细胞中,鱼精蛋白改性磷酸钙的转染效率都要明显高于共沉淀法合成的磷酸钙,同时,发现鱼精蛋白改性磷酸钙能够在合成7天以后仍然具有较好的转染效果,说明鱼精蛋白可能能够提高磷酸钙的稳定性。原子力显微镜照片显示,鱼精蛋白改性磷酸钙颗粒的粒径大小要明显小于共沉淀法合成的磷酸钙,而两者在对细胞活性抑制程度上,没有明显差别。
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