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    鞘氨醇单胞菌的特征及研究进展!


    鞘氨醇单胞菌属是一类丰富的新型微生物资源,可用于芳香化合物的生物降解。该属菌株凭借自身的高代谢能力与多功能的生理特性,在环境保护及工业生产方面具有巨大的应用潜力。但是由于对鞘氨醇单胞菌的认识较晚,该菌的生态价值及经济价值很少被关注,对其的研究也停留在初级阶段。

    一、基本特征

    1990 年日本学者Yabuuchi 等首次提出鞘氨醇单胞菌属,将Holmes 等1977 年从医院临床样本中分离描述的Pseudomonas paucimobilis菌种重新命名为Sphingomonas paucimobilis,且鉴定其为鞘氨醇单胞菌属的典型菌种,并描述了该属的生理生化特性。Takeuchi 等于1993 年对此作了修正。根据16S rRNA 序列比较,鞘氨醇单胞菌属于变形细菌的4 亚类。该属的菌株均为革兰氏阴性菌,无孢子,以单侧生极性鞭毛运动,多呈黄色,专性需氧且能产生过氧化氢酶.除开菊粉外,鞘氨醇单胞菌可将戊糖、己糖及二糖转变成酸。菌体内主要的呼吸链为泛醌Q-10,细胞脂中的脂肪酸以18:1和2OH14:0为主.DNA的G+C含量在61.6% -67.8%之间。细胞膜内的糖鞘脂成分是鞘氨醇单胞菌,这是区别于其它典型革兰氏阴性菌的重要特征。

    由于鞘氨醇单胞菌对芳香化合物有极为广泛的代谢能力,并且该菌属某些菌种能够合成有价值的胞外生物高聚物。因此,鞘氨醇单胞菌近年来成为被关注和研究的热点。

    二、研究进展

    1、降解特性
    鞘氨醇单胞菌在环境中无处不在,河水、根际、地表及深层的地下的沉积物、海洋,甚至极地土壤中都有它们的踪迹。大量的已经从环境中分离出来。鞘氨醇单胞菌的降解特性型生物质聚合体等的降解都有相关。在多环芳烃(PAHs)及六六六(HCH)异构体的降解方面,鞘氨醇单胞菌有着独特的优势。S.yanoikuyaeB1菌株可以降解单环芳烃、联苯、取代芳香化合物及PAHs,是鞘氨醇单胞菌属的模式菌株.B1菌株代谢单环芳烃,如二甲苯与甲苯是采取TOL一质粒代谢途径;苯甲酸则通过meta一断裂途径代谢生成乙醛和丙酮酸盐,如图1所示。尽管很多微生物都可以降解HCH的异构体—HCH,但是只有S.japonicum UT26对·HCH的降解途径研究最为详细。 —HCH降解的最重要的步骤为脱氯反应,如图2所示:.y—HCH降解成2,5-二氯对苯二酚(2,5-DCHQ)涉及到上游途径,2,5-二氯对苯二酚的继续降解属于下游途径。此外,鞘氨醇单胞菌还能够降解蒽醌染料及其中间体。

    2、分类学研究
    随着微生物群落解析技术的发展,鞘氨醇单胞菌的分类学研究也经历了3个阶段。第一阶段是利用传统的培养分离方法,即通过形态学、培养及生理生化特征的比较来鉴定分类鞘氨醇单胞菌。但是,由于鞘氨醇单胞菌的表型特征与其它菌种的相似性,很容易被误归属于其他菌属,因此该法逐渐被第二阶段的生物标记物分类法所取代。生物标记物分类法是通过提取微生物特有的化学成分(即生物标记物),经定性定量分析来确定微生物归属的分类方法。根据鞘氨醇单胞菌的自身特征,逐渐形成了几种独特的生物标记物分类方法,即:颜色分析,呼吸醌系统分析,聚胺模式分析以及极脂和脂肪酸外形分析。

    3、颜色分析
    鞘氨醇单胞菌属的大多数菌株都呈黄色,这种色素用丙酮极易提取,通常在452 nm与480 nm处有特征吸收峰。S.paucimobilis的黄色色素被鉴定为nostoxan—thin.相比之下,S.yanoikuyae菌株含有更少的色素,RW1与Alcaligenes sp.A175菌株不含色素。近年来,研究者也分离出一些橙色的鞘氨醇单胞菌。因此,黄色不能作为鞘氨醇单胞菌属特有的特征,应该与其它分析方法结合使用。

    4、呼吸醌系统分析
    呼吸醌是细胞膜中起电子传递作用的组成成分,主要有两类呼吸醌:泛醌(辅醌Q)及甲基萘醌(维生素K)。每一种微生物都含有一种占优势的醌,对鞘氨醇单胞菌属物种的呼吸醌系统分析发现:它们均含侧链上有10个类异戊二烯基团的泛醌Q.10.虽然这个特征并不局限于氨醇单胞菌,在变形细菌仅亚纲的大多数菌种中也含有,但是从鞘氨醇单胞菌属呼吸醌系统的同源性来看,可能所有的鞘属成员均含有泛醌Q一10

    5、聚胺模式及极脂、脂肪酸外形分析
    在鞘氨醇单胞菌属中,已观察到两种主要的聚胺模式:一种模式是含有大量的三胺合亚精胺及少量可变的腐胺、亚精胺以及精胺;在第二种模式中主要的聚胺为三胺亚精胺和少量的腐胺与精胺。这两种模式把鞘氨醇单胞菌属分成了两大类,第一种模式只存在于Cluster I及RW1与A175菌株中,第二种模式存在于剩余的菌株中(图3)。极脂和脂肪酸外形分析表明:所有的鞘氨醇单胞菌的极脂中均含有磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、双磷脂酰甘油(DPG)和神经鞘糖脂(SGL)。细胞脂中的脂肪酸以18:1和20H14:0为主。Busse等研究发现,聚胺模式与醌系统的分析仅适用于鞘属菌株的初步鉴定,相比之下,极脂和脂肪酸外形的分析对于建立在检测鞘氨醇糖脂类物质亲属80%水平上的鉴定是一种较好的方法.通常,当这两类方法结合使用时就可以从物种水平上鉴定鞘氨醇单胞菌。
    但是生物标记物分类方法仍然存在一定的局限性,随着分子生物学的发展,现代分子生物学分类法逐步成熟,鞘氨醇单胞菌的分类学研究进入了第三阶段.因此,根据鞘氨醇单胞菌属及一些一变形细菌物种的16S rRNA序列的比较,鞘氨醇单胞菌属的物种至少可以分为4个簇。

    6、降解酶与基因的研究
    芳香化合物的好氧降解途径中,芳环羟化双加氧酶与断裂双加氧酶被认为是最关键的酶,它们关系到化合物的可降解性与可降解程度。Gibson等副研究认为,双加氧酶是多组分且依赖于NADH的酶系,由Fe—S黄素蛋白、铁氧还原蛋白及Rieske型Fe—S氧化酶三部分组成。
    对细菌中有关多环芳烃(PAHs)降解的基因,研究最多的是降解萘与菲的假单胞菌的基因。利用萘或菲的不同菌属及菌种的PAHs降解基因间,常常有较高的同源性,尤其是那些编码双加氧酶组分的基因.由于鞘氨醇单胞菌能同时利用高分子量及低分子量的芳香化合物,因此,近年来被认为是一类具有代谢多样性的微生物资源。对降解PAHs的鞘氨醇单胞菌的遗传学进行研究,可以更好地解释鞘氨醇单胞菌能够在各种芳香化合物中生长的原因。在一些鞘氨醇单胞菌中,与PAHs降解有关的基因的序列明显的相似,但是这些基因不同于先前描述的假单胞菌中的基因。利用S.yanoikuyaeB1菌株的PAHs缺失突变株协助基因鉴定,发现几个突变株累积了二氢二醇且脱氢酶基因的表达受到阻碍.两种类型的间位断裂双加氧酶在相反的方向被转录,表明一个问位断裂双加氧酶是在上游途径中起作用,而另一个在下游途径起作用,这与先前报道的假单胞菌属中萘的上下游途径的操纵子类似。此外,在B1的染色体中发现了一个类似于假单胞菌TOL的操纵子,虽然这个基因的排列不同于TOL质粒,但是B1与假单胞菌的TOL基因拥有高度的核酸同源性。S.aromaticivorans F199是从深层地下分离出的鞘氨醇单胞菌的典型代表,其184 kb大小的代谢质粒PNL1的序列已经获得,大约DNA的一半序列编码的基因用于芳族的代谢、芳族的转运及解毒(例如:谷胱甘肽一s一转移酶),而另一半编码用于质粒的复制、接合、转移与维持 J.F199质粒DNA的基因序列和次序与Bl菌中降解PAHs操纵子上的染色体具有很大的保守性。此外,根据所推测的氨基酸序列,F199中有关芳族转化的酶已经从假单胞菌中脱离,而且可能部分解释鞘氨醇单胞菌的代谢多样性.近来的遗传学同源性研究发现,从地下土壤分离到的菌株Bl中的联苯及间二甲苯降解的基因与5个深层地下分离菌株(F199、B0522、B0695、B0478、B0712)的基因很相似。但是,地下菌株的降解基因位于染色体上,而深层地下菌株的降解基因却是在质粒上.有关降解高分子量PAHs的鞘氨醇单胞菌的基因很少有报道。低分子量的PAHs,如萘,能够很容易地被细菌降解,但是更顽固的高分子PAHs,其生物降解途径研究甚少,但是已经证明了它们的初步代谢是由双加氧酶催化完成的。Sandrine等研究了屈降解菌S.CHY一1中有关PAHs的降解酶,对编码两个芳环羟化双加氧酶(Phn I和Phn lI)的基因测序发现:两个不同基因座上的共簇代谢基因与F199中相应的基因相似性很高,单一酶Phn I可能与CHY一1代谢PAHs的最初步骤有关。

    7、鞘脂的研究
    鞘脂是鞘氨醇与脂肪酸形成的脂,广泛存在于哺乳动物及某些细菌与真菌的细胞膜内。已经形成一些从菌体中提纯鞘脂的较为成熟的方法.鞘氨醇单胞菌含有不同寻常的包膜,即在外膜中不存在其它革兰氏阴性菌中的脂多糖,而是存在糖脂类物质.研究发现这些糖脂是由二氢鞘氨醇、2一羟基脂肪酸和葡萄糖醛酸组成,鞘氨醇单胞菌也由此而得名。后来通过核磁共振波谱及化学分析最终证明了这种糖脂是一种鞘糖脂,其结构如图4所示。由于鞘氨醇极易水解的特性加大了其检测难度,有学者曾通过改进的分析纯化方法检测到了鞘糖脂组分的化学结构,并探明所有的鞘菌属中鞘糖脂-1(C-SL-1)是外膜结构的主要成分。
    此外,Kawahara等研究了少动鞘氨醇单胞菌(s pauci—mobilis)的细胞膜结构及其鞘糖脂的功能.结果发现:由于鞘氨醇单胞菌不同于其它革兰氏阴性菌的细胞膜的特征,其形成的疏水表面更益于这些细菌在生态环境中的存活及芳香化物的摄取。更有研究指出,尽管脂多糖与鞘糖脂在细节上有所不同,但是作为抗原表面结构及外膜结构的组成部分它们的功能基本相似。由于鞘脂的含量在菌属及菌种之间是不同的,因此该组分也作为生物标记物辅助其它方法用于鉴定和分类鞘氨醇单胞菌。

    8、产生物高聚物的研究
    许多细菌细胞表面能产生多糖,它们或者吸附在细胞膜表面作为脂多糖(LPS)的O-抗原,或者在细胞周围形成荚膜,又或者作为胞外多糖(EPS)完全分泌出去.微生物的EPS是一种长链的高分子聚合物,其独特的物理学和流变学特性以及使用安全性使它在食品和其它工业中倍受青睐。鞘氨醇单胞菌因能产生胞外生物高聚物而被广泛关注。据报道,有些少动鞘氨醇单胞菌能够产生结冻胶类胞外多糖。结冻胶凭借自身的酸稳定性及结构的多样性可以取代琼脂并被广泛应用于食品及生产工业中。研究工作主要集中在如何提高结冻胶的产量并实现工业化生产。研究表明,Xanthomonas campestris菌种能产生另一种重要的胞外聚合物——黄原胶,同时找到了编码该反应的12个共簇染色体基因。Pollock等利用基因重组技术将这些基因植入鞘氨醇单胞菌体中实现了黄原胶在鞘属菌内的合成,这些黄原胶在结构及功能上与天然黄原胶并无太大区别。以上研究证明,通过细菌间基因的相互转移就可以实现胞外聚合物的生产,同时也表明在非宿主中合成黄原胶及其他胞外聚合物的技术可行性。

    9、结论与展望
    芳香化合物是环境中的常见污染物,利用生物方法去除这类污染物是较有前景的手段.鞘氨醇单胞菌的广泛分布、其对复杂结构的难降解芳香化合物的特异作用,以及在生物聚合物的生产方面的优越性使其受到越来越多的关注。但是由于对其认识较晚,对鞘氨醇单胞菌的研究多数停留在初级阶段,主要的报道多集中在该菌属菌株的分离,降解途经、降解条件优化以及降解产物的分析等方面,而芳香化合物降解的酶系及相关基因的涉及仍然较少,尤其是高分子量芳香化合物的降解基因。结合国际相关研究,以下几个方面仍有待于今后进一步探讨。
    (1)胞外聚合物的生产中,脱去胶中的蛋白是纯化胶类聚合物的技术阻碍,现常用的Sevag法、碱性蛋白酶法、木瓜蛋白酶与中性蛋白酶法各有一定的局限性.因此,开发高效的脱蛋白方法可确保聚合胶的质量,同时寻找鞘氨醇单胞菌生产聚合胶的功能基因,并表达以实现大规模生产;
    (2)作为鞘氨醇单胞菌的重要特征组成——鞘脂在污染物代谢方面的生理意义有待研究;
    (3)鞘氨醇单胞菌在生物降解过程中相关功能基因的克隆、表达,利用生物技术手段构建高效的遗传工程菌并应用于环境污染的治理。此外,有些少动鞘氨醇单胞菌的会引起布水管道腐蚀及作为感染植物病原体的现象都应引起研究者的关注。随着对该菌属生理生态潜能的深入研究,鞘氨醇单胞菌将有着广阔的应用前景。

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