菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养24～48 小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100CFU（菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养 物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7 天，加入3～5ml 含0.05％（v/v）聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数小于100CFU 的孢子悬液。
菌悬液在室温下放置应在2 小时内使用，若保存在2～8℃可在24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
培养基接种 取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基7 支，分别接种小于100CFU 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2 支，另1 支不接种作为空白对照，培养3 天；取每管装量为9ml 的胰酪大豆胨液体培养基7 支,分别接种小于100CFU 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 支，另1 支不接种作为空白对照，培养5 天。逐日观察结果。
结果判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
稀释液、冲洗液及其制备方法
稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
1.0.1%蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH 值至7.1±0.2，分装，灭菌。
2．pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液 取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。
3. 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液(如0.9%无菌氯化钠溶液)。
如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
方法适用性试验
当进行产品无菌检查法时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。
方法适用性试验按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行方法确认。
菌种及菌液制备 除大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。
薄膜过滤法 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100CFU 的试验菌，过滤。加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度培养3～5 天，各试验菌同法操作。
直接接种法 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6 管，分别接入小于100CFU 的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2 管，取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基6 管，分别接入小于100CFU 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 管。其中1 管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1 管作为对照，置规定的温度培养3～5 天。
结果判断 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。 如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。
方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行。
供试品的无菌检查
无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。
无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。
检验数量 检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出厂产品按表1 规定；上市产品监督检验按表2 规定。表1、表2中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。
检验量 是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g 或ml）。除另有规定外,供试品检验量按表3 规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。
阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于100CFU，供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48～72 小时应生长良好。
阴性对照 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。