腐败希瓦菌PCR试剂盒的知识与应用及操作步骤！
小杨 / 2024-01-18 08:46:13
一、背景
腐败希瓦菌PCR试剂盒是一种用于检测腐败希瓦菌的生物试剂盒。腐败希瓦菌是一种常见的食品腐败菌，可引起食品腐败变质，对人体健康产生危害。使用PCR试剂盒可以快速、准确地检测出腐败希瓦菌，对于食品检测和质量控制具有重要意义。
腐败希瓦菌PCR试剂盒通常由一对特异性引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs等成分组成。通过PCR反应，可以特异性地扩增腐败希瓦菌的DNA片段，从而对其进行快速检测。使用这种试剂盒的操作过程相对简单，只需将样品DNA加入到PCR反应液中，经过一系列温度变化和反应后，即可得到检测结果。
腐败希瓦菌PCR试剂盒具有高灵敏度、特异性强、操作简便等优点，适用于食品检测、环境监测等领域。然而，需要注意的是，PCR技术虽然具有高灵敏度和特异性，但也可能受到其他因素的干扰，如DNA提取效率、引物设计等。因此，在使用PCR试剂盒时，需要严格按照操作说明进行，并对结果进行仔细的分析和解释。
1、样本采集：从患者体内采集血液、粪便、组织等样本，并将其保存在无菌容器中。
2、DNA提取：将采集到的样本进行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取试剂盒。提取后的DNA应保存在-20°C或更低的温度下。
3、PCR反应体系准备：根据试剂盒说明书的要求，配制PCR反应体系，包括引物、荧光探针、dNTPs、DNA聚合酶等。
4、PCR反应：将提取的DNA加入到PCR反应体系中，进行PCR反应。反应条件和时间根据试剂盒说明书的要求进行设置。
5、结果分析：将PCR反应后的产物进行荧光信号检测，根据荧光信号的出现情况判断是否存在腐败希瓦菌的感染。
三、应用
从重金属污染的环境中采用Cd2+浓度梯度递增法、极限培养基培养和紫外诱变等方法筛选重金属Cd2+高耐受和富集的菌株,采用腐败希瓦菌PCR试剂盒PCR和16SrDNA序列分析对细菌进行初步鉴定和分析,然后通过重金属Cd2+添加处理实验,测定其对重金属的耐受和富集能力,最后对筛选所得的细菌进行培养条件(温度、pH等)的优化,以期为Cd2+修复工程菌的制备和环境重金属Cd2+的修复建立基础。
实验方法主要是应用不同的筛选和优化方法得到重金属Cd2+高耐受和富集的菌株,通过腐败希瓦菌PCR试剂盒PCR扩增对菌株进行16S rDNA序列分析,将测定的序列提交GeneBank数据库,与数据库中已有的DNA序列进行blastn相似性比对,从而对其进行初步鉴定。在此基础上测定和分析获得的重金属Cd2+高耐受和富集细菌对Cd2+的吸收和耐受能力。
实验结果显示：经过前述三种方法筛选得到三株菌株,其耐受重金属Cd2+浓度在固体培养基上达到150mmol/L,液体培养基里面达到40mmol/L。经腐败希瓦菌PCR试剂盒16S rDNA序列分析初步确定其中两株细菌为同一种细菌(腐败希瓦菌Shewanella putrefaciens),另外一株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。对细菌作高耐受和富集测定及与对照大肠杆菌pop6510比较分析得出,两种菌对重金属的耐受和富集浓度均远高于大肠杆菌pop6510,富集倍数分别达到15倍和6倍。在不同温度、pH和Cd2+浓度下对这两种细菌优化培养条件测定确定,其最适宜生长的温度为30℃,最适pH为7.2,重金属半数致死浓度为40mmol/L。
通过以上工作,初步获得以下结论:通过Cd2+浓度梯度递增方法对细菌的筛选是行之有效的方法,可缩短筛选的进程。紫外诱变得到一株细菌,在诱变实验中存活率低,但在耐受和富集测定实验中长势良好。通过16S rDNA序列分析鉴定细菌的种类是一种简便快捷的方法。通过腐败希瓦菌PCR试剂盒PCR扩增和测定细菌的16S rDNA的序列,直接与GeneBank中已知序列进行比对即可初步鉴定菌种。GeneBank丰富的细菌数据库资源为环境细菌的分析和鉴定开辟了一条重要和简便的有效途径。初步鉴定本实验所筛选得到的细菌为腐败希瓦菌(Shewanella putrefaciens)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)。通过细菌的重金属耐受和富集测定,获得的两种细菌在LB固体培养基上耐受重金属Cd2+浓度达到150mmol/L,液体培养基达到40mmol/L。与大肠杆菌pop6510相比,其耐受重金属Cd2+浓度高于大肠杆菌pop6510,其重金属吸收值显著高于对照菌株。
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