冻融对发酵用大肠杆菌甘油保存的影响！
小杨 / 2020-06-02 08:26:37
1、目的：探讨冻融对发酵用大肠杆菌甘油保存的影响。
2、方法：将大肠杆菌用10%的甘油溶液制成菌悬液，分成3组，测定各组菌种的活菌数，同时置-20℃冷冻处理。3组分别被冻融处理1、2、3次.测定冻融处理后、冻存1年及2年各组的活菌数。
3、结果：随着冻融次数的增加,冻融处理后，冻存1年及2年的活菌数均明显降低，冻融次数越多，细菌存活率越低。
4、结论：反复冻融会降低菌种的存活率。
微生物菌种的保存方法因微生物种类不同而有所不同,国内外对此有较多的报道.甘油保存法是生产中常用的方法之一.在甘油保存菌种过程中,细胞内外形成的冰晶会对细胞造成结构上的损伤,从而影响菌种的存活率.本文主要探讨了反复冻融对发酵用大肠杆菌甘油保存的影响.为制药和微生物工作者提供具有参考价值的数据.
一、材料
大肠杆菌PJLA605-HIL2。
LB固体培养基:胰蛋白胨(英国Oxoid)10 g、酵母抽提物(英国 Oxoid)5 g,氯化钠10 g,溶解并定容至1 000 ml,调pH至7.2,固体培养基加2%琼脂。
二、方法和结果
1、大肠杆菌培养
将待分离的菌种划LB平板,以取得单菌落,经模拟发酵选出优良菌种,将此菌种接到LB斜面上,30℃,培养24 h。
2、大肠杆菌冻存
用10%甘油溶液洗下培养好的菌种,并在无菌小烧杯中混匀,制成浓度为1×108个/ml的菌悬液,然后分装到eppendorf管中,每支eppendorf管加菌液1 ml,将此菌种分成3组,编号1、2、3,然后放入-20℃冰箱中保存。
3、二次冻存
将2.2项中的第2、3组菌种从-20℃冰箱中取出,于28℃～30℃的水浴锅中融化,然后再放入-20℃冰箱冻存。
4、三次冻存
将2.3项中的第3组菌种从-20℃冰箱中取出,于28℃～30℃的水浴锅中融化,然后再放入-20℃冰箱冻存。
5、存活率的测定
采用平板菌落计数法.取LB平板9套,每3套为一组,在每组皿底分别标明10-7、10-8、10-9,再取9个2 ml西林瓶,依次标明10-1、10-2、10-3……10-9,并向西林瓶中各加入无菌水0.9 ml。
用微量取样器精确吸取第1组菌液0.1 ml注入10-1西林瓶中.将10-1西林瓶内的菌液混匀,即成10-1稀释液.再从10-1西林瓶中取稀释液0.1 ml注入10-2西林瓶中,重复上述操作,直至制成10-7、10-8、10-9稀释液。
分别精确取10-7、10-8、10-9稀释液0.1 ml注入对应的LB平板内,用玻璃涂布器涂布均匀,于30℃培养24 h后,数各皿中的菌落数,计算出同一稀释度3个平皿上菌落的平均数,根据菌落数计数活菌数。
用同样步骤可计算出冷冻前3组菌液的活菌数,见表1。
在冷冻后及冷冻后1年、2年分别将3组菌种从-20℃冰箱中取出,于28℃～30℃水浴锅中融化,用平板计数法测定活菌数,计算菌种存活率,如表1。
三、讨论
在冷冻保存菌种时加入甘油作保护剂，虽然可以提高菌种的存活率，但冻融还是会造成菌体结构上的损伤。菌种每冻融一次,其存活率都会明显下降，经处理后的菌种保存1年或2年后,冻融次数越多，其存活率越低。因此，为使菌种有较高的存活率，不宜反复冻融。生产用甘油菌种一般保存1年，对1年后的菌种就要对其筛选活化后再用。