一、背景
小鼠组织直接PCR试剂盒是一款可快速对小鼠鼠尾、鼠耳、肌肉等组织样本进行PCR扩增的试剂盒。本试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系，可以快速的裂解样品并释放出基因组DNA，不需要除去蛋白、RNA等，即可将释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外，样品使用量少，低至5mg小鼠组织或2-5mm鼠尾即可进行实验。小鼠组织直接PCR试剂盒包含了快速制备小鼠组织基因组DNA和后续PCR扩增的所有试剂，适用于从小鼠尾巴、耳朵以及脚趾等组织中一步法提取基因组DNA并用于后续的PCR扩增和检测。整个提取过程不包含匀浆、破碎、过夜消化、酚氯仿抽提、DNA沉淀或柱式纯化等操作，实验操作简便、快捷，而且结果稳定可靠。
小鼠组织直接PCR试剂盒提供的2 x Dir PCR MasterMix是一种高扩增兼容性的PCR试剂，无需彻底去除蛋白等杂质，便能进行高效特异扩增。该预混Mix包含抗体修饰的Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂和稳定剂，操作时只需加入粗提模板和引物即可进行后续检测，具有操作简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点，特别适合于高通量的检测筛选。Mix中预混有电泳染料，可在反应结束后直接进行电泳检测，使用方便快捷。PCR产物的3’端带A，可进行TA克隆。
二、操作方法
样品基因组DNA释放
⒈在离心管中加入100μL Buffer MP，4μL Protease Plus，轻轻涡旋混匀。
⒉取5-10mg动物组织或2-5mm鼠尾，置于上述离心管中，轻轻涡旋混匀。
⒊65℃孵育10-30min，然后95℃处理5min。
⒋12000rpm离心5min。
⒌将上清转移至新的离心管，4℃或-20℃保存或直接用于PCR扩增。
三、应用
用于FAM76B在小鼠各组织中的表达分布和FAM76B基因敲除对小鼠肝脏脂代谢影响的初步研究
FAM76B是由339个氨基酸组成的细胞核蛋白,分子量约为39kDa。人源的FAM76B基因定位于11q21染色体上,全长21468bp,生物学功能尚不明确。通过氨基酸序列比对,发现人的FAM76B氨基酸序列与大鼠、小鼠以及斑马鱼的FAM76B氨基酸序列相似度极高,说明FAM76B氨基酸序列高度保守,也暗示了FAM76B蛋白可能存在重要的生物学功能。
目前已知FAM76B氨基酸序列中存在组氨酸重复序列(poly-His domain)和Lys-225的泛素化(ubiquitination)位点。通过基因本体(Gene Ontology,GO)分析表明,含有组氨酸重复序列的蛋白大多数为核蛋白,其生物学功能与基因转录和神经发育密切相关。FAM76B蛋白定位在细胞核的核散斑体(Nuclear speckles)中,而核散斑体属于细胞核亚结构,可对RNA剪切复合体进行保存和组装。1.FAM76B单克隆抗体的制备及鉴定:用纯化的原核人FAM76B-6His融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合;以纯化的人FAM76B-6His作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选出阳性克隆的杂交瘤细胞。通过有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆,将最终阳性克隆扩大培养,制备针对人FAM76B的单克隆抗体6株,分别命名为FAM76B McAb No.1-6。采用Western blot、免疫沉淀以及免疫细胞化学染色等手段,对所获得的单克隆抗体进行一系列的检测。
FAM76B蛋白在正常小鼠组织中的表达和分布:将人FAM76B蛋白的氨基酸序列与小鼠FAM76B蛋白的氨基酸序列进行比对,发现两者氨基酸序列相似度可达到98%,说明FAM76B蛋白高度保守。用上述所获的针对人FAM76B的单克隆抗体对鼠源FAM76B蛋白进行检测,同时通过Real-time PCR、Western blot及免疫组化的方法检测FAM76B在正常小鼠心、肝、脾、肺、肾、肌肉以及脑组织的表达和分布。通过PCR、Real-time PCR以及Western blot方法对本实验室繁育的FAM76B基因敲除小鼠后代,在基因组水平、RNA水平以及蛋白水平进行鉴定。
FAM76B基因敲除小鼠肝脏脂代谢相关基因表达的分析:利用Real-time PCR方法,检测1,3,6,9,12,15月龄FAM76B+/-小鼠肝脏组织脂代谢相关基因的表达水平:de novo lipogenesis环节中FASN、SCD、ACC、Dgat 1和Dgat 2;脂肪酸氧化途径中Cptl、Acox和Mcad;TG分泌过程中Mtp和Vldlr。同时检测lipin1、SREBP-1、PPARα和PGC-1α的mRNA相对表达量。通过上述研究结果,分析FAM76B基因敲除小鼠肝脏脂代谢异常的主要因素和途径。
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