小鼠肺微血管周细胞的培养操作及作用研究！
小杨 / 2024-04-12 08:55:59
一、背景
小鼠肺微血管周细胞是一种在肺部微血管周围分布的细胞，也称为肺微血管平滑肌细胞。它们的主要功能是调节肺部微血管的张力和通透性，以维持正常的肺功能。
肺微血管周细胞是一种围绕在肺微血管内皮细胞周围的细胞，具有收缩功能。这种细胞嵌入毛细血管内皮细胞的基膜中，通过物理接触和旁分泌信号与内皮细胞进行细胞通讯，监视和稳定内皮细胞的成熟过程。在中枢神经系统中，周细胞包围着内皮细胞。
肺微血管周细胞在肺部疾病中也扮演着重要的角色。例如，在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中，肺微血管周细胞会发生增殖和迁移，导致肺部微血管收缩和通透性增加，从而加重疾病的进展。
此外，肺微血管周细胞还参与了肺部炎症和免疫反应的调节。它们可以释放多种细胞因子和趋化因子，吸引和激活其他免疫细胞，参与炎症反应的发生和发展。
1)复苏小鼠肺微血管周细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)小鼠肺微血管周细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)小鼠肺微血管周细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
通过培养肺周细胞，观察CBDL大鼠血清对肺周细胞及小鼠肺微血管周细胞凋亡和caspase-3表达的影响；观察CBDL大鼠肺细胞及小鼠肺微血管周细胞凋亡、caspase-3表达情况和周细胞的主要标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)、神经元胶质抗原2(neuron-glial antigen2,NG2)、desmin的蛋白水平及其阳性细胞率的变化；抑制caspase-3后检测肺细胞凋亡，α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其阳性细胞率的变化，以及肺微血管扩张和血氧交换情况，证明如下假设：CBDL产生的血清因子变化，通过血液循环作用于肺微血管，致caspase-3激活，肺周细胞凋亡，进而引起肺微血管扩张、血氧交换异常和低氧血症，最终揭示肺周细胞凋亡在HPS实验模型肺微血管扩张中的重要作用。
方法：
1、CBDL大鼠血清对肺周细胞及小鼠肺微血管周细胞凋亡的作用研究1.1肺周细胞的培养和鉴定。1.2采用CBDL法构建HPS大鼠模型，收集CBDL1wk血清。1.3CBDL大鼠血清培养肺周细胞后，分别用TUNEL和western blot检测其凋亡和caspase-3表达情况。
2、CBDL大鼠中肺周细胞的变化研究2.1采用CBDL法构建HPS大鼠模型。2.2分别用TUNEL和western blot检测CBDL大鼠肺细胞的凋亡和caspase-3的表达。2.3分别用western blot和免疫组化法检测CBDL大鼠肺α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其阳性细胞率的变化。
3、抑制caspase-3对CBDL大鼠肺周细胞的影响及HPS的作用研究3.1采用CBDL法构建HPS大鼠模型，手术后第一天起每天给模型大鼠腹腔注射caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK，连续2wk。3.2用TUNEL法检测抑制caspase-3后CBDL大鼠肺细胞的凋亡情况。3.3分别用western blot和免疫组化法检测抑制caspase-3后CBDL大鼠肺α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其阳性细胞率的变化。3.4分别用血气分析和HE染色法观察抑制caspase-3后CBDL大鼠血氧交换和肺微血管扩张情况。
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