细胞冻存与复苏的实验原理与步骤及注意事项！
小杨 / 2024-03-02 08:30:32
一、知识简介
细胞冻存与复苏是一种用于长期储存细胞的技术。在这个过程中，细胞被置于低温环境中，减缓其代谢活动。通过将细胞冷冻保存在液氮中（通常为-196℃），细胞暂时脱离生长状态，但其细胞特性得以保存。当需要时，可以通过复苏将这些冻存的细胞重新激活，以供实验使用。这种方法能够适度地保存一定数量的细胞，防止细胞受到污染或其他意外事件的影响，从而发挥了细胞保种的作用。
二、实验原理
（一）细胞冻存原理：
细胞冻存的原理在于降低细胞温度至零度以下时，会引起以下变化：细胞器会脱水，细胞内可溶性物质浓度增加，并形成冰晶。
缓慢冷冻的过程可以逐渐使细胞脱水，以防止细胞内形成大冰晶。因为大冰晶可能导致细胞膜和细胞器的损伤和破裂。而快速复苏的目的是防止小冰晶再次结合成大冰晶，即防止冰晶的再结晶过程。
（二）低温保护剂的应用原理：
1、增加渗透压稳定性：在细胞冻存过程中，加入低温保护剂可以增加细胞的渗透压稳定性，从而减缓细胞在慢速降温过程中的脱水和皱缩现象，显著提高了冻存效率。
2、DMSO的作用：常用的低温保护剂是DMSO（二甲基亚砜），它是一种渗透性保护剂。DMSO能够迅速透入细胞，并提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓了冻结过程。这样一来，细胞在冻结前会透出水分到细胞外部，在细胞外形成冰晶，从而减少了细胞内部的冰晶形成，有效减少了冰晶对细胞的损伤。
三、实验步骤
（一）材料准备
1、仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。
2、玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250 ml、100 ml）、废液缸。
3、塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10 ml）、15 ml 离心管、冻存管（1～2 ml）。
4、其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。
5、试剂：D-Hanks 液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4% NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。
（二）细胞冻存
1、配制冻存培养液：配制含10% DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液。
2、处理细胞：取对数生长期的细胞，使用胰蛋白酶将单层生长的细胞消化下来，对于悬浮生长的细胞，直接将细胞移至15ml离心管中。
3、离心：进行1,000 rpm，5分钟的离心。
4、调整细胞密度：去除胰蛋白酶和旧的培养液，加入适量的配制好的冻存培养液。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后计数并调节冻存液中细胞的最终密度为5×10^6/ml～1×10^7/ml。
5、分装细胞：将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml。
6、标记冻存管：在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间及操作者。
7、冻存过程：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；直到-100℃时，可迅速浸入液氮中。另一种方法是将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2小时，然后放入-70℃冰箱中过夜，最后将冻存管移入液氮容器中。
（三）细胞复苏
细胞复苏的步骤如下：
1、取出冻存管：从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动，促使其尽快融化。
2、处理细胞悬液：从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，将其加入离心管中，并滴加10倍以上的培养液，然后混匀。
3、离心：进行1,000 rpm，5分钟的离心。
4、调整细胞密度：弃去上清液，加入含10%小牛血清的培养液以重悬细胞。进行计数，调整细胞密度后，将其接种到培养瓶中，并置于37℃培养箱中，静置培养。
5、继续培养：次日更换一次培养液，继续进行培养。
四、细胞冻存、复苏注意事项
1、确保细胞状态良好：在冻存之前，确保细胞具有良好的形态，并且没有污染。
2、选择适合的冻存液：根据细胞类型选择合适的冻存液，并按照相应的操作规程进行细胞的冻存。
3、控制细胞密度：要控制好细胞的密度，避免过低或过高影响冻存效果。不同的冻存液针对不同细胞有适当的冻存密度范围，以确保细胞在冷冻和复苏过程中的存活率。
4、尽快冷冻：细胞悬液加入冻存液后尽量短时间在常温放置，因为常温下DMSO对细胞会造成损伤。建议尽快通过程序降温或一步法等方式进行细胞的冷冻保存。
5、合理存放：细胞长期存放在-80℃冰箱时，建议靠冰箱内侧放置样本，避免开关冰箱导致温度不稳定影响细胞保存效果。
6、检测存活率：细胞冻存后应取出一管进行复苏，并检测细胞的存活率。为稳妥起见，可在细胞冻存半年后进行复苏培养，并观察细胞生长情况后继续冻存。
7、温和解冻：使用适当的方法解冻细胞，如将冻存管放入37°C的水浴中直至完全解冻。避免使用高温或暴露时间过长的方法，以减少DMSO对细胞的毒性作用。
8、匀速摇晃：细胞融解过程应匀速、均一地摇晃以加速融解，同时避免流体剪切力对细胞的损伤。
9、尽快去除DMSO：已融解的冻存细胞应尽快在常温下存放，并尽快离心去除DMSO。
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