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    人前列腺癌细胞的传代流程与应用!


    一、背景

    LNCAP人前列腺癌细胞是从一位50岁白人男性(血型B+)的左锁骨淋巴结针刺活检中分离,该患者经确诊为前列腺癌转移。LNCaP clone FGC细胞对5-α-二氢睾酮(生长调节子和酸性磷酸脂酶产物)有响应。

    LNCaP clone FGC细胞并不形成一致的单层,而是形成集落,在传代时可以用滴管反复吹吸打碎。LNCaP clone FGC细胞仅仅轻轻地吸附在基底上,不形成汇合,很快使培养基变酸。LNCaP clone FGC细胞生长极其缓慢,传代后48小时内不应扰动。

    当培养瓶封包后,多数LNCaP clone FGC细胞从培养瓶底分离,悬浮在培养基中。收到后,在通常培养单层细胞的条件下培养24-48小时,以使细胞再贴壁。此后,可以换上新鲜培养液。如果需要,培养瓶内容物可以收集,300g离心15分钟,以10毫升培养液重悬并培养到一个单独的培养瓶中。

    二、细胞传代流程

    (1)吸出原培养瓶中的培养基,PBS缓冲液润洗细胞两次,加2-3ml0.25%胰酶进行消化细胞(注意把握消化时间,通常控制在1-2min)

    (2)注意培养基PH值变化情况,定期换液(每周2-3次),待细胞密度达到80%以后重复1项操作或者冻存

    (3)取部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中,添加适当的完全培养基,把细胞悬液打匀,于培养箱中培养

    (4)镜下观察消化情况,在HS505.T人淋巴结成纤维样细胞生长特性边缘缩小,贴壁松动时(不建议消化到细胞漂浮)去掉胰酶,加6-8ml完全培养基,轻轻吹打细胞层,尽量把细胞层吹落,吹散。

    三、应用

    用于GNMT的表达及调控对人前列腺癌细胞系LNCap和PC3生物学特性的影响研究:

    研究GNMT的体外调控对人前列腺癌细胞系LNCap和PC3的分化、凋亡、增殖和侵袭性等各项生物学特性的影响。

    方法:细胞培养液中分别加入GNMT(10μg/ml)和SAH(10ng/ml)来上调和下调LNCap和PC3细胞内GNMT的活性。在12h、24h、36h和48h这4个时间点,光镜下观察细胞分化,TUNEL和流式细胞法检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞侵袭性。

    结果:①光镜观察第48h,GNMT和SAH处理过的LNCap和PC3细胞形态在200倍光镜下观察,均没有发生明显变化,延长培养时间至5d后结果仍是一样。

    ②TUNEL两种细胞中凋亡率,GNMT组均低于对照组,SAH组均高于对照组。其差异在LNCap细胞中GNMT组和对照组之间,第48h无统计学意义,p>0.05,第12h、24h和36h有统计学意义,p<0.05;SAH组和对照组之间,4个时间点均有统计学意义,p<0.05。在PC3细胞中GNMT组和对照组之间,第12h和48h无统计学意义,p>0.05,第24h和36h有统计学意义,p<0.05;SAH组和对照组之间,第12h无统计学意义,p>0.05,第24h、36h和48h有统计学意义,p<0.05。

    ③流式细胞两种细胞中凋亡率,GNMT组均低于对照组,SAH组均高于对照组。其差异在LNCap细胞中3组之间两两比较,4个时间点均有显著统计学意义,p<0.01。在PC3细胞中GNMT组和对照组之间,第48h无统计学意义,p>0.05,第12h、24h和36h有统计学意义,p<0.05;SAH组和对照组之间,4个时间点均有显著统计学意义,p<0.01。

    ④MTT两种细胞中吸光度值,GNMT组均高于对照组,SAH组均低于对照组。其差异只在PC3细胞中的48h时间点SAH组与对照组之间有统计学意义,p<0.05。

    ⑤Transwell两种细胞中穿膜细胞数,GNMT组均高于对照组,SAH组均低于对照组。其差异在两种细胞中均在36h和48h时间点才有统计学意义,p<0.05。

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