破伤风梭菌培养基基础的背景与应用！
小杨 / 2020-09-27 08:31:41
一、背景
破伤风梭菌培养基基础是专供破伤风梭菌生长的基础培养基，主要用于破伤风梭菌培养及伤风梭菌产毒。破伤风梭菌毒素是破伤风杆菌产生的一种神经蛋白质毒素，通过抑制抑制性神经递质的释放，引起超反射反应和横纹肌痉挛。
典型症状是在肌紧张性收缩(肌强直、发硬)的基础上，阵发性强烈痉挛，通常最先受影响的肌群是咀嚼肌，随后顺序为面部表情肌、颈、背、腹、四肢肌，最后为膈肌。
相应出现的征象为：张口困难(牙关紧闭)、蹙眉、口角下缩、咧嘴“苦笑”、颈部强直、头后仰；当背、腹肌同时收缩，因背部肌群较为有力．躯干因而扭曲成弓、结合颈、四肢的屈膝、弯肘、半握拳等痉挛姿态，形成“角弓反张”或“侧弓反张”；膈肌受影响后，发作时面唇青紫，通气困难，可出现呼吸暂停。破伤风杆菌是引导起破伤风的病原菌，大量存在于人和动物肠道中，由粪便污染土壤，经伤口感染引起疾病。
该菌株在普通琼脂平板上培养24～48小时后，可形成直径1mm以上不规则的菌落，中心紧密，周边疏松，似羽毛状菌落，易在培养基表面迁徙扩散。在血液琼脂平板上有明显溶血环，在疱肉培养基中培养，肉汤浑浊，肉渣部分被消化，微变黑，产生气体，生成甲基硫醇(有腐败臭味)及硫化氢。一般不发酵糖类，能液化明胶，产生硫化氢，形成吲哚，不能还原硝酸盐为亚硝酸盐。该菌株在生物技术领域具有一定的应用，然而在常用的培养基中破伤风梭菌增殖速度较慢，同时易发生染菌现象。
二、应用
用于提高破伤风类毒素免疫原性的初步研究：
破伤风梭菌产生的破伤风毒素，经0.4%甲醛灭活后,失去毒性而仍保留抗原性称之为破伤风类毒素。类毒素精制后,可作为疫苗对人和动物进行免疫接种。但机体感染后不能获得终身免疫力，且此免疫程序较长。为了减轻接种的副反应，提高免疫效果，减少注射次数，提高接种覆盖率，采用原核细胞表达具有高免疫原性的重组C蛋白，用于生产疫苗及免疫接种，以避免出现副作用；另外，用双功能交联剂戊二醛聚合破伤风毒素，使毒素分子之间进行交联，从而产生分子量较大的，表面决定簇多的聚合类毒素。
该类毒素作为免疫的抗原，可以诱发较高的抗体水平，加强免疫记忆，延长保护机体免受破伤风的侵害的时间。
1、利用PCR技术从破伤风梭菌基因组DNA中扩增出1356 bp的破伤风毒素C基因，将该基因片段插入到表达载体pET32a(+)中，转化宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达，观察各种条件下对重组菌蛋白表达的影响。
对重组后蛋白用Ni-NAT亲和层析的技术纯化C融合蛋白，然后进行小鼠免疫实验并测定效价。研究显示：经SDS-PAGE分析,重组破伤风毒素C蛋白(rTTC)的表达量占可溶性蛋白的28.19%,纯化后得到蛋白纯度为96.92%。免疫印迹证实该重组蛋白是破伤风毒素C蛋白抗原，对小鼠免疫,三免后14 d rTTC组小鼠抗体效价仍能达到1∶16 000。所获得的重组蛋白具有良好的免疫原性。
2、经过厌氧培养的破伤风梭菌，产毒后进行脱毒、精制，在产毒期间进行毒力鉴定、解毒和毒性逆转实验。再由戊二醛聚合破伤风类毒素，经不同的聚合条件的优化，进行分子量和Lf的测定，然后免疫小鼠和兔子，并测定其免疫效价。培养的毒素可以作为制备类毒素使用，脱毒精制后的类毒素,经毒力鉴定试验、解毒试验和毒性逆转试验检测后均合格。
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