小鼠小胶质细胞原代培养！
小杨 / 2020-02-12 09:48:56
微生物查询网：组成中枢神经系统的细胞大部分是神经胶质细胞，包括大胶质细胞（星型胶质细胞和少突胶质细胞）和小胶质细胞。小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞，具有提呈抗原、分泌多种细胞因子、吞噬病原体和坏死组织的作用，被认为是脑内的单核巨噬细胞。由于小胶质细胞在颅内免疫反应中的重要作用，对小胶质细胞的研究已成为热点。
小胶质细胞的体外培养是小胶质细胞功能研究的重要途径，在此本文将给大家梳理一下小鼠小胶质细胞原代培养。
一、实验动物：
新生 24h 内清洁级小鼠。
二、主要试剂：
1、PBS：用购自中山公司的PBS粉剂，每袋加ddH2O定容至1000ml，调pH7.2，高压灭菌消毒。
2、0.25%胰蛋白酶消化液：使用时浓度为0.25%，含0.02%EDTA，制备时即取250mg胰酶和20mgEDTA溶于100mLPBS溶液，并在无菌操作台上用0.22um一次性过滤器过滤，50ml分装，4℃保存。
3、接种液配制：用DMEM-F12 基础培养90%，再加入10%胎牛血清，最后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 U／mL，置于4℃冰箱保存。
4、抗生素：青霉素(80万U)和链霉素(100万U)在无菌操作台内以高压灭菌过的双蒸水溶解分别加入4ml灭菌水/青霉素，5ml灭菌水/链霉素)，配制成20万u/ml分装，置于-20℃冰箱保存，临用时4℃解冻，注意尽量避免反复冻融，并使培养基最终浓度为100 u/ml。
5、0.01% L-多聚赖氨酸溶液的配制：称量 10mg L-多聚赖氨酸，溶于 100ml 灭菌去离子水，0.22μm 正压滤器过滤分装，-20℃保存。
6、0.4%台盼蓝溶液的配制
台盼蓝 4 g
PBS 少许（研磨）
PBS 定容至 100ml，滤纸过滤，室温保存。
7、4%多聚甲醛的配制：
多聚甲醛 4 g
PBS 溶液 100ml
加热至 60℃，边滴加 1mol/L NaOH 边搅拌，至液体澄清。
8、四噻唑兰溶液配制：
MTT 50mg
PBS 10ml
磁力搅拌 30min，灭菌 0.22µm 微孔滤膜过滤分装，4℃保存，两周有效。
三、实验步骤：
1、培养板的包被
（1）将盖玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，浸洗、烘干。
（2）经 5%盐酸浸泡30min，自来水冲洗20min，三蒸水冲洗，浸泡过夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精灯烤干，放入 24 孔细胞培养板。
（3）用 0.01%的 L-多聚赖氨酸溶液包被培养皿和小玻片，37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。
去除 L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。
2、小鼠小胶质细胞的混合培养
（1） 75%（体积分数）酒精消毒新生 24h 内的清洁级小鼠，在无菌条件下断头，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2,无钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。
（2） 无菌剥离脑组织，除去小脑、海马、大脑髓质,分离大脑皮层，仔细剥离脑膜及血管。
（3）用虹膜剪将组织剪切成 1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期间振摇 2～3 次。
（4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗两次。巴斯德吸管轻轻吹打至肉眼观察无明显的脑组织团块，静置 2min。
（5）悬液收集于新的离心管，离心（1000r/min，10 min，4℃），弃去上清液。加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。根据实验需要接种于若干个25cm细胞培养瓶或培养皿中。
（6）置 37℃、5%CO2培养箱培养24h后更换一次培养基，以后每3d换一次液，并在镜下观察细胞的生长和存活情况。
3、小胶质细胞的分离和纯化
（1）细胞培养14～16d左右,在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象, 即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的星型胶质细胞,小胶质细胞明显偏小呈类圆形、折光性强,附着于星型胶质细胞表面生长。
（2）倒掉培养液,用0.05%胰酶2～3mL消化,边观察边轻轻晃动培养瓶,等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来,将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10mL离心管，立刻用完全培养基终止消化。
（3）离心管配平,1000r/min, 离心5min, 弃上清；加定量完全培养再次吹打成细胞悬液,接种于预先包被的置有盖玻片的24孔培养板,置于CO2恒温细胞培养箱(37度)培养。
生长24h后吸掉培养液,以去除未贴壁的少突胶质细胞,加完全培养液继续培养。
四、注意事项：
跟神经元取材一样，一定注意拨除干净血管网；
小胶质细胞长多后再分离；
前期可以用神经元培养基培养两天；
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