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人外周血染色体的制备!百欧博伟生物

小杨 / 2019-10-08

正文


1. 实验原理 
人的外周血淋巴细胞培养方法是1960年由Moorhead 提出来的。正常情况下,人外周血小淋巴细胞都处在G1期(或G0期),但在体外给予一定的条件,进行培养,经72 h就可获得大量的有丝分裂细胞。这种取材简易、用血量少的培养方法已被广泛采用。
在培养液中加入植物血凝素(PHA),淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞,进入有丝分裂。短期培养后,经秋水仙素处理,可抑制细胞分裂时纺锤丝的形成,使细胞分裂停止在中期,同时它可改变细胞质的黏度,引起染色体在细胞质中分散。经低渗和固定,即可得到大量的、分散效果好的染色体分裂象。人体的1ml外周血中一般含有约(1~3)×106个小淋巴细胞,足够染色体标本制备和分析之用。本 节介绍人外周血淋巴细胞的悬浮培养法,以及染色体标本的制备。

2. 试剂与器材
(1)2ml注射器、培养瓶、刻度吸管,需15磅灭菌20min。离心管、吸管、量筒、载玻片,经洗液按常规清洗、烘干备用。
(2)超净工作台,恒温培养箱,天平,离心机、显微镜等。
(3)试剂:
① 培养基的配制:
RPMI 1640培养基     4ml
小牛血清            1ml
青霉素和链霉素      各100IU/ml
PHA                 0.2ml
肝素                1小滴
以5% NaHCO3调pH至7.2~7.4, 4℃备用。
② 肝素:称取0.2g溶于100ml双蒸水中,浓度为0.2%,灭菌。
③ 秋水仙素:生理盐水配制成20μg/ml浓度,灭菌,分装,置-20℃。
④ 低渗液:0.075mol/L KCl。
⑤ 固定液: 甲醇∶冰乙酸(3∶1),临时配制。
⑥ Giemsa工作液:1份原液和9份磷酸缓冲液,临时配制。
⑦ 磷酸缓冲液:1/15mol/L Na2HPO4、1/15mol/L KH2PO4等体积混合。
⑧ 5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。

3. 实验步骤
(1)接种,培养。
① 在无菌条件下,用灭菌注射器吸取0.2%肝素液(生理盐水配制,灭菌)0.2ml,湿润针筒后,采静脉血1~2ml、转动注射器使血液与肝素充分混匀。
② 无菌条件下,将肝素化血液滴入至外周血培养基内,每5ml培养液内滴入血滴28~30滴(7号针头)轻轻混匀。
③ 置37℃恒温箱内,静止培养68~72h。注意第二天观察培养液有无凝血、溶血或长菌的现象,可每天将培养液摇一摇以便细胞得到充分培养。
④ 终止培养前2~3h,加入浓度为20μg/ml的秋水仙素,每5ml培养基中用7号针头,加3~4滴使最终浓度为0.1μg/ml。轻轻摇匀后,再放入恒温箱内,继续培养2~3h,以积累较多停止在中期的分裂象。

(2)制片。
① 收获细胞:由恒温箱取出培养瓶,用吸管充分吹打培养瓶瓶壁,使细胞全部脱离瓶壁,然后将细胞液移至锥形离心管内,1500转/min,离心10min,去上清液。
② 低渗处理:加入37℃预温的0.075mol/L KCl 8ml,反复吹打(约一百次)后,置37℃水浴箱中低渗处理25min左右。
③ 预固定:加入新鲜制备固定液1ml(甲醇∶冰醋酸=3∶1),轻轻混匀。
④ 离心:2000转/min,离心10min,吸弃上清液。
⑤ 固定:沿离心管壁慢慢加入固定液8ml,轻轻混匀,固定10min。
⑥ 离心:同上,吸去上清液。
⑦ 再固定:加固定液8ml,混匀,固定10min。
⑧ 离心:同上,吸去上清液。
⑨ 制细胞悬液:根据细胞量多少,加入适量固定液,充分混匀,制成细胞悬液。
⑩ 滴片:取出预先经冰水浸泡的载玻片,用吸管吸取混匀的细胞悬液在离冰片约30cm距离进行滴片,每片约滴2~3滴细胞悬液,使细胞较好分散。一般每一培养瓶可制3~5张标本片。
染色:标本晾干后,即可用染液(Giemsa液原液1份,pH6.8的磷酸缓冲液9份)染色15min,自来水冲洗后(从背面冲洗)晾干。

(3)镜检:人类每个体细胞有46条染色体,根据染色体的长度和着丝粒位置的不同,可以分成22对常染色体和一对性染色体,男子是46,XY;女子是46,XX。

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