小鼠单核巨噬细胞白血病细胞的培养操作及应用！
小杨 / 2024-04-08 09:28:04
一、背景
RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）是一种源自小鼠的白血病细胞系，常用于生物学和医学研究。这种细胞系是从患有单核细胞白血病的雄性小鼠的脾脏中分离出来的，并经过连续传代培养而形成的。RAW 264.7细胞具有巨噬细胞的特性，如吞噬作用、抗原提呈和产生细胞因子等。
在细胞培养方面，
RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞通常需要在含有DMEM（杜氏改良Eagle培养基）或RPMI 1640培养基的培养瓶中培养，同时添加10%的胎牛血清（FBS）和1%的抗生素-抗真菌混合物以维持细胞生长并防止污染。这些细胞通常在37°C、5%CO2的湿润环境中生长。
RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞还可以用于研究各种刺激物（如细菌、病毒、寄生虫、细胞因子等）对巨噬细胞的影响，以及巨噬细胞在免疫反应中的作用。此外，这些细胞也被广泛用于药物筛选和毒理学研究，以评估药物对巨噬细胞功能和生存能力的影响。
1)复苏RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
利用LPS诱导RAW264.7细胞建立氧化应激和炎症反应模型,初步证实酿酒酵母β-葡聚糖的抗氧化作用。然后,在氧化应激模型基础上,探究酿酒酵母β-葡聚糖对RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞抗氧化、抗炎及抗凋亡的分子作用机制,为预防和治疗氧化应激相关性疾病提供新的思路。本研究主要从细胞信号通路转导方面对酿酒酵母β-葡聚糖抗氧化、抗炎和抗凋亡作用机制进行研究。
结果如下：
(1)试验一以LPS为诱导物,氧化应激和促炎细胞因子作为建立氧化应激和炎症模型指标,探究LPS对RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞氧化损伤效果。结果表明:0.1～5μg/m L LPS处理RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞12 h后,细胞内氧化应激指标MDA和ROS产生显著增多,抗氧化指标SOD、CAT和GSH-Px酶活性显著降低;细胞培养上清液中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α释放显著增多,细胞内COX-2和i NOS含量显著升高。综合多项指标,以1μg/m L LPS作为建立细胞氧化应激和炎症模型的最佳浓度。
(2)试验二在试验一基础上,初步探讨酿酒酵母β-葡聚糖对LPS诱导的RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞氧化应激和炎症损伤的缓解作用。
结果表明：酿酒酵母β-葡聚糖增强抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px和HO活性,抑制LPS诱导的MDA和ROS产生而发挥抗氧化作用,降低IL-1β、IL-6和TNF-α的释放以及COX-2和i NOS水平而起到抗炎效果,推测可能是酿酒酵母β-葡聚糖激活抗氧化转录因子从而发挥预保护作用。这些结果充分说明β-葡聚糖具有抗氧化和抗炎的双重调节作用,从而抑制细胞内ROS产生,进而对RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞起到保护作用。但其调控抗氧化和抗炎信号转导机制仍需在氧化应激模型中进一步验证。
(3)试验三以试验二为基础进行深入性研究,本试验旨在探讨β-葡聚糖抑制LPS诱导的RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞氧化应激分子机制。为阐明β-葡聚糖抗氧化的分子机制,我们设计了β-葡聚糖添加试验,结果表明:β-葡聚糖能够激活其受体Dectin-1介导的Nrf2/HO-1信号转导通路。氧化应激模型中,在LPS抑制Nrf2和HO-1表达的条件下,β-葡聚糖能显著上调LPS诱导的Dectin-1、Nrf2和HO-1的表达,抑制ROS产生,但β-葡聚糖这些作用可被Dectin-1抑制剂Laminarin、Nrf2抑制剂ML385和HO-1抑制剂Sn PP逆转。该结果表明β-葡聚糖可以通过Dectin-1/Nrf2/HO-1信号通路抑制LPS诱导的RAW 264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）细胞氧化应激。
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